抑制骨髓間充質干細胞成脂分化能力對骨質疏松

周彪+安奇君+劉強

[摘要] 目的 探討抑制骨髓間充質干細胞（BMSCs）成脂分化能力對骨質疏松（OP）的早期療效。 方法 選取雌性SD大鼠40只，采用背側入路摘除卵巢法建立大鼠OP模型。隨機分為4組：A組（假手術組）、B組（模型組）、C組（BMSCs治療組）、D組（RNAi轉染BMSCs治療組），每組10只。造模后7 d經尾靜脈分別注射生理鹽水、10%胎牛血清的LG-DMEM培養液、BMSCs、RNAi轉染BMSCs，BMSCs來自課題組從SD大鼠骨髓中提取并經過流式細胞儀和誘導分化染色鑒定的BMSCs，RNAi轉染BMSCs來自課題組前一部分體外實驗中使用腺病毒轉染后的BMSCs。干預后，依照分組行骨密度（BMD）、骨轉換標志物檢測。比較4組大鼠的骨轉換標志物在OP早期骨形成與骨吸收過程中的變化。 結果 D組的BMD顯著高于B、C組（P<0.05），而與A組差異無統計學意義（P>0.05）；D組的PⅠNP高于B、C組（P<0.05），而與A組差異無統計學意義（P>0.05）；D組的β-CTX低于B、C組（P<0.05），而與A組差異無統計學意義（P>0.05）。 結論 RNAi轉染BMSCs可提高去勢大鼠的BMD，促進骨形成。

[關鍵詞] RNA干預；骨髓間充質干細胞；骨質疏松；骨密度；Ⅰ型前膠原氨基端前肽；β-Ⅰ型膠原羧基端肽

[中圖分類號] R681 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2015）09（c）-0014-03

Experimental study of restraining fat differentiation ability of bone marrow mesenchymal stem cells for early curative effect of osteoporosis

ZHOU Biao1 AN Qi-jun1 LIU Qiang2▲

1.Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China；2.Department of Orthopedic，Shanxi Academy of Medical Sciences，Shanxi Dayi Hospital，Taiyuan 030032，China

[Abstract] Objective To explore the early curative effect of restraining fat differentiation ability of bone marrow mesenchymal stem cells （BMSCs） in osteoporosis （OP）. Methods 40 female SD rats were selected.Osteoporotic of rats model was established by dorsal approach ovary removal method.Rats were randomly divided into four groups：group A （sham-operated group），group B （model group），group C （BMSCs treatment group） and group D （RNAi transfection BMSCs treatment group）.Each group has 10 rats.After 7 days moldeling，rats in four groups were injected saline，LG-DMEM culture contained 10% fetal bovine serum，BMSCs and RNAi transfection BMSCs.BMSCs were extracted from SD rat bone marrow of and identified by flow cytometer and induced differentiation dyeing.RNAi transfection BMSCs were from the transfected BMSCs of adenovirus used for the former parts of in vitro experiment in research group.After intervention，bone mineral density （BMD） and markers of bone turnover were tested according to grouping.The change of bone turnover markers of rats in bone formation and bone resorption of the early osteoporosis was compared among four groups. Results BMD in group D was higher than that of group B and C （P<0.05），but had no significant difference compared with group A （P>0.05）.PINP in group D was higher than that of group B and C （P<0.05），but had no significant difference compared with group A （P>0.05）.β-CTX in D group was lower than that of group B and C （P<0.05），but had no significant difference compared with group A （P>0.05）. Conclusion RNAi transfection BMSCs can improve BMD of castration rats and promote bone formation.

[Key words] RNA interference；Bone marrow mesenchymal stem cells；Osteoporosis；Bone mineral density；Procollagen type Ⅰ N-terminal propeptide；β-C-terminal cross-linking telopeptide of typeⅠcollagen

骨質疏松癥（osteoporosis，OP）是以低骨量和骨組織微細結構破壞為特征，導致骨脆性和骨折危險性增加的一種全身骨骼性疾病[1]。在我國，OP患者已經達到2億以上，占總人數的15%左右，在我國60歲以上的老年人中約30%患有OP[2]，其不僅增加社會負擔和經濟負擔，而且降低生活質量甚至還可能導致殘疾。

我們課題組在前期體外實驗研究中發現，Evi1基因在骨髓間充質干細胞（BMSCs）向脂肪分化的過程中起決定性作用，通過RNA干擾技術抑制其表達，阻斷BMSCs的脂肪分化過程，同時又促進BMSCs的成骨分化。本實驗以SD大鼠制備OP模型，觀察Evi1基因在動物體內是否存在同樣的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

選取健康雌性SD大鼠40只，體重為180～250 g，由北京軍事醫學科學院實驗動物中心提供（批號：SCXK2007-004）。BMSCs來自課題組從SD大鼠骨髓中提取并經過流式細胞儀和誘導分化染色鑒定的BMSCs，RNAi轉染BMSCs來自課題組前一部分體外實驗中使用腺病毒轉染后的BMSCs。Ⅰ型前膠原氨基端前肽（procollagen type Ⅰ N-terminal propeptide，PⅠNP）和β-Ⅰ型膠原羧基端肽（β-C-terminal cross-linking telopeptide of typeⅠcollagen，β-CTx）ELISA試劑盒由上?？泼羯锟萍加邢薰咎峁?。

1.2 方法

1.2.1 模型制備 采用經典的卵巢去勢法。以脊柱兩側為入路完整摘除雙側卵巢，結扎輸卵管。

1.2.2 動物分組及處理 將雌性SD大鼠隨機分為4組：A組（假手術組）、B組（模型組）、C組（BMSCs治療組）、D組（RNAi轉染BMSCs治療組），每組10只。假手術組僅切除卵巢周圍些許脂肪，未摘除卵巢；B、C、D組大鼠均建立OP模型。在去勢7 d后，A、B組經尾靜脈分別注射1 ml DMEM低糖培養液；C、D組分別注射1 ml BMSCs（1×106）和RNAi轉染BMSCs（1×106）。尾靜脈注射后28 d采獲血液與大鼠雙側股骨標本。

1.2.3 骨密度（bone mineral density，BMD）測定 使用XR-46雙能光子骨密度儀測定大鼠右側股骨標本的BMD。

1.2.4 骨轉換生化標志物檢測 骨轉換生化標志物包括骨形成標志物（PⅠNP）和骨吸收標志物（β-CTx）。分別于干預后28 d，4組大鼠麻醉后，開腹暴露腹主動脈，經腹主動脈采獲血液標本，ELISA試劑盒檢測Ⅰ型前膠原氨基端前肽和Ⅰ型膠原羧基端肽。

1.3 統計學分析

數據采用SPSS 19.0統計軟件進行分析，計量資料以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

D、C組的BMD顯著高于B組（P<0.05），而與A組差異無統計學意義（P>0.05）；D組的BMD顯著高于C組（P<0.05）；D、C組的PⅠNP顯著高于B組（P<0.05），而與A組差異無統計學意義（P>0.05），D組的PⅠNP顯著高于C組（P<0.05）；D、C組的β-CTx顯著低于B組（P<0.05），而與A組差異無統計學意義（P>0.05），D組的β-CTx顯著低于C組（P<0.05）（表1）。

表1 4組股骨BMD、PⅠNP、β-CTX的比較（x±s，n=40）

與B組比較，*P<0.05；與C組比較，#P<0.05

3 討論

常用于OP的模型動物有大鼠、小鼠、犬、兔、羊、靈長類動物等[3]。大鼠骨代謝與人有許多相似之處，隨年齡增長出現骨量丟失，具有與人相似的骨松質分布及重建功能，卵巢切除后出現較高的骨轉化率并對性激素有與人相似的反應性等[4]，雌性大鼠去勢導致的骨量丟失和人類絕經后OP有許多相似之處[5]。大鼠成為建立OP模型應用最廣的動物。

目前利用雙光能X線吸收法（dualenergy X-ray absorptiometry，DXA）測量BMD 是診斷OP的重要手段[6]，因此在本實驗開始前已經對4組SD大鼠的雙側股骨使用組織鉗鈍性分離其軟組織，并在測量過程中選了4組大鼠右側股骨測量BMD并記錄其面積（cm2）、骨礦含量（g），最大限度地減少主觀因素所帶來的誤差，以便分析其統計學意義。

本實驗結果顯示，D、C組的BMD顯著高于B組（P<0.05），而與A組差異無統計學意義（P>0.05），說明RNAi轉染BMSCs和BMSCs能夠避免大鼠去卵巢后發生骨量丟失現象，且未達到正常骨量。D組的BMD顯著高于C組（P<0.05），提示RNAi轉染BMSCs更能減少股骨骨量丟失。

目前，PⅠNP和β-CTx是常見的骨形成及骨吸收標志物[7-8]，骨轉換生化標志物檢測中，PⅠNP是反映成骨細胞功能狀態的直接或間接產物，是鑒定細胞骨向分化的重要標志[9]。本實驗中，D、C組的PⅠNP顯著高于B組（P<0.05），而與A組差異無統計學意義（P>0.05），說明RNAi轉染BMSCs和BMSCs能夠避免大鼠去卵巢后成骨細胞中大量的Ⅰ型前膠原分泌到細胞外，且未達到正常水平。D組的PⅠNP顯著高于C組（P<0.05），說明RNAi轉染BMSCs可使大鼠去卵巢后成骨細胞中大量的Ⅰ型前膠原分泌到細胞外水平優于BMSCs。β-CTx是反映骨吸收過程中破骨細胞分泌的骨組織產物。本實驗中，D、C組的β-CTx顯著低于B組（P<0.05），而與A組差異無統計學意義（P>0.05），說明RNAi轉染BMSCs和BMSCs能夠避免大鼠去卵巢后骨吸收過程中骨膠原降解，且未達到正常水平。D組的β-CTx顯著低于C組（P<0.05），說明RNAi轉染BMSCs可使大鼠去卵巢后骨吸收過程中骨膠原降解低于BMSCs[9]。

BMSCs是在各種因素誘導下可以分化為成骨細胞、脂肪細胞、神經元等。成骨細胞通過分泌骨基質作用成骨，在礦物質代謝、血管再生、骨的再吸收過程中有重要作用[10]。當BMSCs的分化能力改變時可能會導致疾病的發生[11]。OP中骨形成減少的病理核心是成骨細胞數量和功能下降[12]，因此可以通過誘導干細胞向成骨細胞分化來增加成骨細胞的數量從而用于OP的治療。干細胞分化受到多種因素的影響，激素、細胞因子等都會影響其分化方向，促進其向成骨細胞分化[13]。目前通過干細胞治療OP的方法主要有自體或異體干細胞移植，激素或細胞因子體外注射誘導體內干細胞分化，體外物理作用誘導干細胞分化[14]。張暉等[15]用 Lentivirus 載體構建了可以在間充質干細胞內穩定表達針對過氧化物酶增殖體激活受體基因序列的小干擾 RNA，將基因修飾的間充質干細胞注射于骨質疏松的動物模型。目前，實驗已經證實，通過干細胞可以達到治療OP的目的，由于其改變了骨代謝，因此可以從根本上治療OP[14]，期望通過RNAi轉染BMSCs后對骨質疏松過程促進骨轉換過程促進成骨，抑制成脂，在最大程度上提高RNAi轉染BMSCs的存活率與其他繼發因素帶來的連鎖反應，可能會為骨質疏松形成過程中促進成骨帶來更加確切的效果，而實驗的結果也表明了大鼠OP早期RNAi轉染BMSCs可以促進成骨。通過以往的研究和實驗結果，相信隨著分子生物學的發展，RNAi轉染BMSCs會被越來越廣泛地應用于OP治療中，為OP治療提供新思路。

[參考文獻]

[1] 王曉光，孫運德.骨質疏松藥物治療研究進展[J].中國醫藥，2012，7（5）：652-654.

[2] 郭勁宇，耿晨杰.骨質疏松癥的流行病學趨勢與防治進展探討[J].無線互聯科技，2014，（4）：224.

[3] 張萌萌.中國老年學學會骨質疏松委員會骨代謝生化指標臨床應用專家共識[J].中國骨質疏松雜志，2014，20（11）：1263-1272.

[4] Peris P，Alvarez L，Monegal A，et al.Biochemi calmarkers of bone turnover after surgical menopause and hormone replacement therapy[J].Bone，1999，25（3）：349-353.

[5] Nakasato YR，Janckila AJ，Halleen JM，et al.Clinical significance of immunoassays for type-5 tartrate-resistant acid phosphatase[J].Clin Chem，1999，45（12）：2150-2157.

[6] 劉曉建，王猛，劉杰，等.右側股骨近端骨密度測量價值的探討[J].中日友好醫院學報，2014，28（6）：347-349.

[7] Li M，Li Y，Deng W，et al.Chinese bone turnover marker study：reference ranges for C-terminal telopeptide of typeⅠcollagen and procollagenⅠN-terminal peptide by age and gender[J].PLoS One，2014，9（8）：e103841.

[8] 歐萌萌，黃建榮.絕經后婦女骨質疏松癥患者血清中β-Crosslaps、PⅠNP和N-MID檢測的評價[J].標記免疫分析與臨床，2011，18（4）：238-240.

[9] Chachra D，Lee JM，Kasra M，et al.Differential effects of ovariectomy on the mechanical prooperties of cortical and cancellous bones in rat femora and vertebrae[J].Biomed Sci Instrum，2000，36：123-128.

[10] Watanabe K，Ikeda K.Osteoblast differentiation and bone formation[J].Nippon Rinsho，2009，67（5）：879-886.

[11] Yamaza T，Miura Y，Bi Y，et al.Pharmacologic stem cell based intervention as a new approach to osteoporosis treatment in rodents[J].PLoS One，2008，3（7）：e2615.

[12] Gruber R.Cell biology of osteoimmunology[J].Wien Med Wochenschr，2010，160（17-18）：438-445.

[13] Justesen J，Stenderup K，Kassem MS.Mesenchymal stem cells.Potential use in cell and gene therapy of bone loss caused by aging and osteoporosis[J].Ugeskr Laeger，2001， 163（40）：5491-5495.

[14] 賈懿劼，田京.干細胞治療骨質疏松癥的可能與可行[J].中國組織工程研究與臨床康復，2012，12（1）：148-152.

[15] 張暉，程驚秋，黃強，等.瞬時干擾PPARγ基因促進酒精誘導下人骨髓基質干細胞成骨分化的實驗研究[J].中華醫學雜志，2008，88（37）：2603-2608.

（收稿日期：2015-05-15 本文編輯：許俊琴）