原生質體單核化技術在白靈菇菌種提純復壯中的應用

李莎+劉宇+馬康+馬元偉+李明+許峰

摘要：為了探索原生質體單核化技術在白靈菇菌株提純復壯中的應用，用退化的白靈菇菌株自10進行原生質體單核化，得到121個原生質體單核菌絲，通過平扳對峙試驗，選取2個菌落中間有突起的部位轉接至新PDA平板，鏡檢保留有鎖狀聯合的菌株，最后得到1株菌絲潔白、濃密的菌株，命名為自交45×49。通過測定菌絲生長速度、生物量、木質纖維素降解酶的活性對復壯菌株進行評價，結果顯示，自交45×49菌株與白10菌株在液體PDB培養基中培養10d后的菌絲生物量分別為1.58、0.90mg/mL；一級種與二級種菌絲生長速度差異未達0.01顯著水平；自交45×49菌株的漆酶活性比白10強43.47%。由此證明原生質體單核技術在白靈菇菌株的提純復壯中應用的可行性。

關鍵詞：菌種退化；白靈菇；原生質體單核化；提純復壯

中圖分類號：S646.101 文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2015）05-0248-02

白靈菇（Pleurotusnebrodensis）屬于擔子菌門傘菌目側耳科側耳屬，肉質鮮美，有“素鮑魚”的美稱，但是菌種退化問題一直困擾著白靈菇的育種進程。而菌種退化導致的產量、生物學效率、商品價值降低，畸形菇數量增加，經濟效益減少也制約白靈菇的工廠化發展。那么，如何對菌種進行提純復壯成了關鍵問題。漆酶是含有4個銅的胞外氧化酶，屬于銅藍氧化酶，存在于菇、菌及植物中，可以選擇性地降解木質素，而退化的菌株漆酶含量會下降；纖維素酶是一個由多種水解酶組成的復雜的酶系，產生纖維素酶的菌種易退化，退化后其產酶力明顯降低。本試驗采用原生質體單核化技術，以白10作為試驗材料，進行單核菌絲平板對峙試驗，獲得1株優良復壯的菌株，命名為自交45×49。通過測定自交45×49和白10在PDA平板和大試管栽培料中的菌絲生長速度、生物量、漆酶和纖維素酶活力，以驗證提純復壯菌株的生長活力。

1.材料與方法

1.1菌種材料

本試驗的白10菌株來自北京市農林科學院植物保護環境保護研究所食用菌研究室。

1.2供試培養基

PDA綜合培養基、PDB液體培養基、RM再生培養基、大試管培養基的成分均見文獻[3]。

1.3主要試劑的配制

0.6mol/L甘露醇穩滲液、2%溶壁酶溶液、滲透壓穩定劑的配制參見文獻[4]；ABTS溶液的配制參見文獻[5]；3，5-二硝基水楊酸試劑（DNS）、0.05mol/L檸檬酸緩沖液（pH值5.0）、1%羧甲基纖維素鈉（CMC）溶液的配制見文獻[6]。

1.4試驗方法

（1）原生質體單核化：具體過程參見文獻[7]。（2）菌絲生物量的測定：具體過程參見文獻[8]。（3）蛋白含量、漆酶活性的測定：具體過程分別參見文獻[5，9]，其中蛋白含量采用BCA蛋白定量試劑盒測定。（4）纖維素酶活性的測定：具體過程參見文獻[6]。

1.5數據分析

試驗均設3次重復，結果采用SPSS軟件對數據之間的差異顯著性進行分析。

2.結果與分析

2.1自交45×49和白10的菌絲生長速度和生物量

原生質體提取后在顯微鏡下測定濃度100萬～1000萬個/mL，稀釋后涂板，挑取單個菌落鏡檢得到121個單核菌絲。平板對峙試驗后，獲得1株菌絲潔白、濃密的菌株，鏡檢有鎖狀聯合，命名為自交45×49（圖1）。

2.1.1自交45×49和白10的生長速度由圖2可知，自交45×49和白10在平皿上的平均生長速度分別為10.17、10.70mm/d，且二者在0.01水平差異不顯著。由圖3可知，自交45×49和白10在大試管上的平均生長速度分別為3.0、2.81mm/d，且二者在0.01水平差異不顯著。

2.1.2自交45×49和白10的菌絲生物量由圖4可知，自10、自交45×49平均菌絲生物量為0.9、1.58mg/mL，可見自交菌株的菌絲生物量明顯高于退化的白10菌株。

2.2生物酶活性的測定

2.2.1蛋白含量的測定蛋白含量與吸光度的回歸方程為y=0.0016x-0.0083，r²=0.999，蛋白含量在50～400μg/mL范圍內，溶液蛋白含量與D562nm呈線性關系。

2.2.2葡萄糖標準曲線的繪制葡萄糖標準溶液濃度與吸糖含量在0.08～0.56mg/mL范圍內，葡萄糖含量與D540nm呈線性關系。

2.2.3自10和自交45×49的蛋白含量和酶活力的測定結果由表1可知，自10的蛋白含量、漆酶活力、濾紙酶活力、羧甲基纖維素酶活力分別為4.5%、25.64U/mg、1.43U/mg、1.23U/mg；自交45×49的相應指標分別為4.1%、35.03U/mg、1.43U/mg、2.87U/mg。自交菌株發酵菌絲中的蛋白含量雖然降低了，但是生物酶活力卻相對增強了，其中漆酶活力更是比退化的白10菌株增強了36.62%，可見經原生質體單核化技術得到的自交菌株改善了退化菌株的菌絲生長活力，說明原生質體單核化技術在一定程度上可以改善白靈菇菌株的退化現象。

3.結論與討論

樊曉琳等曾用原生質體單核化技術提純復壯雙孢蘑菇As2796，并證明原生質體單核化技術提純復壯菌株是最好的方法；譚琦等利用原生質體單核化技術，以香菇栽培種Lel和野生種70#為親本，通過原生質單核體雜交選育出申香8號，在大面積推廣后成為優良菌種；吳小平等將原生質體技術應用于靈芝的雜交育種中獲得了24個優良的雜交菌株；江玉姬等將原生質體單核化技術應用于金針菇的育種中，證明原生質體單核化技術可為白色金針菇的品種改良提供一個新途徑。由此可見，原生質體單核化技術已被廣泛應用于食用菌育種領域，但是對菌種的提純復壯還未有更深入的了解。

一般對菌種進行提純復壯采用的都是優化培養基法，或是進行出菇再組織分離。優化培養基法操作簡單、耗費時間短，但是效果不是很明顯；出菇再組織分離法效果明顯，但是周期比較長、過程復雜。本試驗在前人研究的基礎上采用原生質體單核化技術提純復壯菌絲可以比更換培養基達到更好的效果，且比出菇試驗簡便，在很大程度上縮短了菌種復壯周期。

本研究從菌絲形態、生長速度、菌絲生物量和生物酶活力方面分析了自交45×49和白10菌株的區別，結果表明，自交45×49的菌絲生長活力優于退化的菌株，證明了原生質體單核化技術在白靈菇菌株提純復壯中應用的可行性。endprint