黑素皮質素2型受體相關研究進展

陳凱　謝駿　梁利國　習丙文

摘要：黑素皮質素受體是一種G蛋白偶聯受體，它在下丘腦一垂體一腎上腺皮質軸調控的應激應答中扮演著重要角色。MC2R本身由1條多肽鏈構成，具有7個跨膜的α螺旋，其相應配體促腎上腺皮質激素（ACTH）是唯一能激活MC2R的內源性物質，與此同時，MC2R對輔助蛋白（MRAP）具有嚴格的依賴性，只有MRAP存在的情況下，才能實現MC2R的功能表達，前人對其結構、功能和進化開展了大量研究。本研究就MC2R及其配體（ACTH）、輔助蛋白（MRAP）以及這一受體在魚類應激方面的研究進行了簡要概述，為漁業生產中的應激防控提供理論依據。

關鍵詞：黑素皮質素受體一2（MC2R）；促腎上腺皮質激素（ACTH）；輔助蛋白（MRAP）；應激調控

中圖分類號：S942 文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2015）05-0016-05

黑素皮質素2型受體（melanoeortin-2 receptor，MC2R）屬于G蛋白偶聯受體的一個亞家族，具有7個跨膜的α螺旋，由1條多肽鏈構成，包括3個胞內環、3個胞外環以及短的氨基末端和羧基末端，其中氨基末端區域是已知G蛋白偶聯受體家族中最短的。通過對鳥類以及四足類等大量動物MC2R的氨基酸序列比對發現，第一胞內環、第二胞內環、第二跨膜區、第三跨膜區以及第七跨膜區表現出高度的保守性。這一保守性在關于MC2R的研究中被證實參與到配體結合位點的構成。

早期，Schwyzer等對包括人類在內的哺乳動物黑素皮質素2型受體及其配體促腎上腺皮質激素（adrenoeortieotropiehormone，ACTH）的結構與功能進行了大量研究。后來陸續出現非哺乳類動物MC2R相關研究，先后在鳥類、四足類動物（包括爬行類和兩棲類）、硬骨魚類以及軟骨魚類中發現了MC2R基因，上述研究成果為MC2R基因在進化方面的研究提供了豐富的研究材料。同時也有報道表明，MC2R在藥理特性方面表現出對配體的高度選擇性[即MC2R僅為ACTH激活，黑素細胞刺激素（melanoeyte-stinmlating hormone，MSH）類型的黑皮質素受體激動劑不能激活MC2R]；MC2R在機體組織中的分布與功能表達存在限制性，并證實對黑素皮質素2型受體輔助蛋白（melanoeortin-2 receptor accessory protein，MRAP）存在依賴性。MC2R只有在MRAP存在時才能實現由內質網向細胞膜表面的遷移，而最終實現功能表達還需要1型輔助蛋白（melanoeortin-2 receptor accessory protein，MRAPl）的參與。

下丘腦一垂體一腎上腺在哺乳動物應激過程中的調控方面發揮著重要作用，動物在應激源刺激之后，下丘腦釋放促腎上腺皮質激素釋放激素作用于垂體前葉，使垂體前葉促腎上腺皮質激素細胞合成加工并釋放促腎上腺皮質激素（ACTH），ACTH作用于腎上腺，并與MC2R結合啟動相關信號通路，誘導皮質醇合成。目前，已在哺乳動物的相關研究中證實，MC2R被ACTH激活后誘發的cAMP積累對皮質醇的合成具有關鍵作用；而在硬骨魚中，皮質醇的合成分泌是在頭腎腎間組織中完成的。類似于哺乳動物中的下丘腦一垂體一腎上腺調控軸，在硬骨魚類中由下丘腦、垂體以及腎間組織構成。早期研究中只是對頭腎中MC2R基因進行了簡單的檢測，后來通過分子技術以及原位雜交的手段確定了MC2R的存在，最終通過體外試驗的方法證實皮質醇同ACTH的關系，為下丘腦一垂體一腎上腺/腎間組織軸在魚類中的存在提供了依據，為魚類中的應激調控研究提供了理論結構基礎。

本文綜述了近年來對MC2R相關配體、輔助蛋白以及應激調控方面的研究進展，為實際生產中的應激防控提供理論依據。

1.MC2R的配體

迄今為止，在哺乳動物、鳥類、爬行動物、兩棲動物以及魚類代表物種中，關于MC2R的研究均顯示其在配體選擇性方面具有專一性，即MC2R不能被MSH類型的MCRS配體激活，僅能被ACTH激活。Schwyzer等在MCRS相關配體結構的研究中發現，能激活MCRS的配體均含有H⁶F⁷R⁸W⁹結構，以致于一度被認為，MSH類型的配體雖不能激活MC2R，但存在與MC2R結合的能力，即MSH類型的配體可能與ACTH之間存在著競爭抑制的關系。隨著研究深入，結果證實，MSH類型的配體雖然同ACTH有同樣的H6FR8W9結構，但仍然不能與MC2R結合，試驗中也證實MSH類型配體的存在并不能抑制ACTH同MC2R結合。

最初被研究的MC2R配體是人類的ACTH，因其由39個氨基酸構成，所以被記作ACTH（1-39），早期研究中，通過對氨基酸序列的比對以及對ACTH（1-39）的人為改造（包括切除/丙氨酸替換等方式）以及自然突變體的研究發現，包括ACTH（1-39）在內的MCRS配體均具有H⁶F⁷R⁸W⁹結構。然而，由于MC2R表現出在配體選擇性方面有異與其他MCRS的專一性，說明其在結構上應有相應的特殊性；與此同時，Schwyzer等也發現，當類似物ACTH（1-24）[為人工改造的ACTH（1-39）的類似物，具有同ACTH（1-39）完全相同生物活性]的R18、R17、K16殘基被刪除時，ACTH（1-39）類似物ACTH（1-16）顯示出的相關生物活性的消失與降低以及類似物ACTH（11-24）對ACTH（1-39）的拮抗作用，都顯示出碳端某種重要結構的存在。最終，ACTH的K15K16R17R18結構得以發現。2004年，Costa等進一步指出hACTH（1-24）中的P19殘基也參與到這一結構序列的組成，于是這一結構被拓展為K15K16R17R18P19結構。

隨后有研究進一步顯示，MC2R雖然與其他MCRS有相同的結合H⁶F⁷R⁸W⁹結構的位點，但其在自然狀態下是被隱藏了，因此ACTH與之相結合的過程并不是一步完成，于是雙重結構模型被提出。在MC2R中與ACTH結合相對應的位點中只有H⁶F⁷R⁸W⁹結合位點暴露在外，在兩者發生結合時，K15K16R18P19結構首先與MC2R上的對應位點相結合，繼而改變MC2R的空間構象，致使H⁶F⁷R⁸W⁹結構的對應位點暴露，然后H⁶F⁷R⁸W⁹結構得以與MC2R相應位點結合，最終促發下游偶聯蛋白。Schwyzer將ACTH（1—24）中的K15K16R17R18結構定義為定位結構序列，它能選擇性的結合到ACTH受體上，但其本身不具備激活受體的能力。而H⁶F⁷R⁸W⁹結構被定義為信息結構序列，當其與ACTH受體結合時，相應的下游應答反應隨即出現。因此，MC2R的激活需要H⁶F⁷R⁸W⁹和K15K16R17R18等2種結構同時存在；由于a一MSH只具備H⁶F⁷R⁸W⁹結構，缺少K“K“驢R”結構，使得儀一MSH不具備激活ACTH受體的能力，因而不能誘導腎上腺細胞產生糖皮質激素。

在雙重結構模型中，一旦K15K16R17R18P19結合位點被相應結構結合，就會導致H⁶F⁷R⁸W⁹結構結合位點暴露，有研究提出，K15K17R17R18P19結合位點與相應結構結合之后，a一MSH能激活MC2R，因為a一MSH同樣具有H⁶F⁷R⁸W⁹結構。而在Navolotskaya等的研究中發現，類似物ACTH（11-24）以及源自人類白細胞介素前體一1a（pro—interleukin一1a）雖然能結合受體上的K15K16R17R18P19位點；但其氮端可能干擾a-MSH的進入，從而不適合這一猜想的驗證。因此，在驗證性試驗中使用了ACTH（15—24），它既保證K15K16R17R18P19結構與其結合位點的正常結合，又避免對H⁶F⁷R⁸W⁹結合位點的干擾。試驗中將hMC2R/mMRAP轉染CHO細胞以hACTH刺激作為陽性對照，使用組合a-MSH與ACTH（15—24）或者是組合ACTH（4—10）和ACTH（15—24）共同刺激作為試驗組。結果發現，僅對照組受體被激活，試驗中均未引起受體的激活。這顯示K15K16R17R18P19結構和H⁶F⁷R⁸W⁹結構之間可能還存在一些關鍵的氨基酸殘基。進一步研究顯示，以丙氨酸替換基中的任何一個時，都會對人類MC2R的激活造成干擾，而對四足爬行動物的相關研究同樣顯示丙氨酸替換會引起不同程度的影響。其中，3種四足爬行動物的MC2R結構十分相似，因此出現的不同影響是由ACTH的精細三級結構變化造成的。那些同時具備K15K16R17R18P19結構以及H6F7R8W9結構而中間缺失了氨基酸殘基的ACTH（1—21）以及ACTH（1—22）類似物之所以不能激活受體是由G10K11P12V13G14結構所擁有的精細調控功能喪失所造成的。最終MC2R的結構被劃分為3個結構區域。

近年來，有關MC2R的研究中所涉及相關配體3個區域的細節方面的研究，常常采取丙氨酸替換的方式對單一或是幾個氨基酸的重要性進行評價分析。對人類、兩棲類以及爬行動物H⁶F⁷R⁸W⁹結構進行研究時發現，3個物種在W9殘基被丙氨酸替換時均表現出生物活性的完全喪失。對于人類MC2R而言，丙氨酸替換之后造成的破壞程度緊居其后是F7和R8，造成影響最小的是r。爬行動物和兩棲類對H⁶F⁷R⁸W⁹結構的要求更加嚴格，丙氨酸替換F7、R8、W9都會阻礙其與受體結合，在爬行動物中，甚至是H6發生替換也會阻礙其對相關受體激活。至于K15K16R17R18P19結構中，由丙氨酸替換時，人類MC2R相較于爬行類和兩棲類的MC2R有更高的耐受能力?？傮w上看來，丙氨酸替換試驗與早期依賴于ACTH類似物的研究結果很一致，結果支持早期提出的配體ACTH雙重結構模型，即H⁶F⁷R⁸W⁹結構與K15K16R17R18P19結構是配體激活受體必需條件。

在ACTH丙氨酸替換試驗中所表現出來的，高等動物明顯存在高于較低等動物的耐受性，從進化的角度來看，這可能是進化過程中生物形成的保護機制，進而減少由于偶然突變帶來的不利影響。而在海七鰓、白斑角鯊以及文昌魚的研究中發現，ACTH在受體親和力方面明顯比MSH類型的配體更具優勢。與此同時，在藥理方面的研究中ACTH的效能也明顯高于MSH類型的配體。由此原始受體對天然激動劑的相關表現來看，ACTH較MSH類型配體更原始。

2.MC2R輔助蛋白

在MC2R的研究中發現其分布與其他MCRS相比，存在明顯的局限性，MC2R基因幾乎只能在腎上腺皮質的細胞中才能實現功能表達，如INS-1β-cells。在人類有關MC2R的研究中，對腦、肝臟以及腎上腺3種組織（其中MC2R僅能在腎上腺中實現功能表達）中的cDNA進行RT-PCR操作，結果發現了1個僅在腎上腺中表達的基因，最終證實為MC2R輔助蛋白（MRAP）。在大量關于MC2R進行研究利用中國倉鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）細胞系對非哺乳動物MC2R進行研究，基本上都需要MRAPl的存在，才能實現MC2R的功能表達，僅米氏葉吻銀鮫例外。

就目前研究結果可知，MRAP存在MRAPl（MRAPa和MRAPβ）和MRAP2（MRAP2a和MRAP2b）2個類型。MRAP為單鏈肽鏈，含有1個橫跨膜區域，在內質網中，MRAP單體以同源二聚體存在。在這一聚體、二聚體中，2個多肽以反向平行的方式結合。在內質網中，2個MRAPl二聚體同1個MC2R二聚體形成1個復合物，最終以這種六亞基復合物的形式遷移到細胞膜上。MRAP在內質網中參與協助MC2R正確折疊，如果缺少MRAP的存在，MC2R不能進行折疊，隨后將插入到內質網膜中，最終被內質網的監控機制所清除。雖然MRAPl與MRAlY2在輔助MC2R向細胞膜上遷移的效能是等價的，但是，只有MC2R同MRAPl相互結合之后的構象才能在細胞膜上同ACTH發生反應。

Simon等研究還發現，當MRAP2存在時，MRAPa和MRAPβ的表達量會增加；而當MRAPoz或MRApβ存在時，MRAlY2的表達量也會增加。將MRAPoz和MRAPβ進行生物活性比較，結果顯示，MRAPoβ存在時MC2R的復合物對ACTH具有更高的效能，而這一結果源于MARP的碳端結構，試驗結果證實，當以碳端切除之岳的MRAP類似物與MC2R進行共表達時，MC2R復合物對ACTH的親和力顯著降低。由此顯示MRAP碳端結構與MC2R復合物對ACTH的親和力密切有關。

以MRAPl基因進行系統進化分析，結果表明，四足爬行動物與硬骨魚類的MRAPl基因在進化上呈現出不同趨勢。Travis等在其研究中也證實了這一現象，試驗通過將兩棲類的MC2R基因分別與鼠、斑馬魚的MRAPl基因共表達于CHO細胞中，再以人源ACTH進行激活，結果顯示，鼠MRAPl基因存在的1組中應答明顯更為強烈；而在cAMP應答試驗中，斑馬魚MRAPl存在時，虹鱒MC2R對于ACTH的應答明顯強于鼠MRAPl存在時的表現。結果顯示，MC2R與相應的輔助蛋白間存在協同進化。

通過對哺乳動物、鳥類、四足類動物（包括爬行類和兩棲類）、魚類以及早期脊椎動物（無頜類）等大量物種的MRAP基因序列進行比較分析，結果在早期脊椎動物（如海七鰓鰻）的研究中發現MRAP2存在，而MRAPl缺少，反映出MRAP2為早期MRAP家族的成員；研究結果還顯示，MRAP在肉鰭魚類、兩棲類以及爬行類動物中缺失；而鳥類以及哺乳動物則同時存在MRAP中的2個類型。

3.MC2R

研究者對MC2R的結構進行了相應的研究，例如，Pogozheva等應用計算機模擬，結合點突變的方法對人類MC4R的H6FRsW9結構結合位點進行研究?；谀M結果，H6FR8W9結構結合位點由TM2、TM3、TM6和TM7中的殘基構成，這些殘基在受體中形成一個親水口袋，并暴露于細胞外的空間中。結果顯示，G蛋白偶聯受體的跨膜區域擁有1個筒狀構型。在這一構型中，4個跨膜區域相互之間靠得很近。在人類MC2R的相關研究中同樣得到了類似的H6F7R8W9結構結合位點，相關氨基酸殘基（E81、D107、F136、H139）分別位于TM2、TM3和TM6。Chen等采用單一丙氨酸突變的方法對E81、F136、H139等氨基酸殘基進行替換，結果發現每一個單一丙氨酸替換之后的MC2R突變體對hACTH刺激應答能力顯著下降。并且發生在TM7中F258氨基酸殘基的自然突變，同樣引起受體刺激應答能力下降。系列研究結果顯示，hMC2R中H6F7R8W9結構結合位點的構成殘基位于TM2、TM3、TM6和TM7上。此外，1個發生在人類MC2R的EC2中的H17殘基的自然突變對hACTH刺激應答能力下降。研究者對EC2以及TM5區域進行丙氨酸替換試驗時發現，EC2以及TM5區域發生突變時，hACTH（1—24）不能激活受體，由于EC2和TM5相對遠離構成H6F7結構的結合位點，因此，提出EC2以及TM5參與了KRlIRl8p19結構結合位點的構成。MC2R預測結構見圖1。

Kovalitskaia等提出了MC2R與MRAP的模型，如圖2所示，MRAP二聚體中的1個MRAP分子同MC2R的第三、第四跨膜區結合，從而對ER信號分子的捕捉進行修飾。同時，另1個MRAP分子與第四、第五跨膜區共同構建了KKRR結構的結合位點。當ACTH特異性結合到KKRR結構結合位點時，促使第四、第五跨膜區同第六、第七跨膜區的結合發生分離，進而形成HFRW結構的結合位點，最終激活下游信號。

4.MC2R與機體的應激調控

硬骨魚中皮質醇是一種腎間組織分泌的主要的類固醇類，其在調節應激應答中扮演著重要角色，但其在應激應答過程中的釋放受下丘腦一垂體一腎間組織軸調控。其中皮質醇的合成是由ACTH與位于腎間組織中的MC2R受體結合后所介導合成釋放的。在虹鱒攝食含硒日糧的相關研究中發現，急性應激導致血清皮質醇濃度顯著升高期間，血清ACTH（應激1 h后）含量也會顯著升高，而MC2R mRNA的表達量也顯著上調，在鯉魚的相關研究中也有類似的結論。在關于MC2R基因的相關研究中發現，MC2R基因突變導致的MC2R失活，會阻斷對ACTH刺激的應答反應，從而阻礙皮質醇合成。在早期垂體切除試驗中觀察到血清皮質醇濃度下降，當以ACTH進行處理時，則避免了血清皮質醇濃度下降。這反映出ACTH對皮質醇合成的影響。而在一些魚類的毒理性試驗中，則反映出MC2R本身對于皮質醇合成的影響；例如，以有機氯、β一萘黃酮或是鎘離子處理腎間組織時，研究人員發現ACTH對皮質醇合成的刺激失效，而使用cAMP進行處理時，觀察到皮質醇水平的升高。試驗結果表明，MC2R及其配體在魚類應激調控中的重要作用。

5.結論

MC2R之所以有別于其他MCRS，主要體現在2個方面：一是其對配體選擇的專一性，就目前已有研究而言，絕大多數的研究結果都顯示出MC2R只能被ACTH激活，這一現象的闡明得益于對ACTH中K15K16R17R18P19、H6F7RsW9、等3個結構區域的認識；二是由于MC2R對于輔助蛋白MRAP依賴性所表現，MC2R從內質網向細胞膜表面的遷移需要MRAP的輔助，并且幾乎所有MC2R功能表達的實現都離不開MRAPl的存在。就MC2R的這2個特點而言，其起源尚不明確，MCRS僅出現于脊索動物的共識以及米氏葉吻銀鮫在MC2R功能表達的特殊表現都顯示出魚類MC2R相關研究，今后還需進一步加強魚類MC2R相關基礎研究。

在生理機能的研究中，MC2R與其配體都是皮質醇合成過程中的關鍵，并且參與下丘腦一垂體一腎間組織軸的構建，大量研究結果顯示，MC2R及其相關配體在魚類應激方面緊密相關。但是，對于應激過程中基因表達量的變化是否引起蛋白水平上的量變，或是僅僅引起受體本身敏感度的變化還有待進一步研究。目前，魚類在相關技術方面與高等動物還存在差距，相關研究手段在魚類中的應用尚存在困難。因此，對魚類等低等脊椎動物MC2R的研究不僅有助于了解魚類在應激下皮質醇合成釋放的基本機制，而且對整個漁業的健康發展也具有重要意義。