蘇姜豬Lrh—I基因PCR—SSCP多態性及其與產仔數的關系

王利紅　袁旭紅　魏萍萍　張瑞　王維　李丹　林偉

摘要：為深入研究蘇姜豬肝受體類似物質-1（Lrh-I）基因的多態性及其與產仔數性狀間相關性，依據NCBI數據庫中豬Lrh—I基因核酸序列設計2對引物，采用聚合酶鏈式反應一單鏈構象多態性（PCR-SSCP）方法對蘇姜豬Lrh-I基因進行多態性檢測。檢測結果顯示，引物P1 PCR擴增產物存在7種SSCP條帶型，共有4個堿基突變位點，分別為27287662、27287593、27287535和27287511位；引物P2 PCR擴增產物存在2種SSCP條帶型，堿基突變位于27423038位；將擴增序列與豬Lrh-1CDS區進行比對分析，其中27287662、27287593和27423038位的堿基突變位于配體結合域（LBD）區內，且突變均屬同義突變，表明LBD區對于Lrh-I基因功能穩定具有重要作用；不同堿基突變位點的基因頻率經群體遺傳學分析，除27287511位點處于群體不平衡狀態（P<0.05）外，其他位點均達群體平衡狀態（P>0.05）；Lrh-I基因}）1和P2擴增區SSCP不同類型蘇姜豬第1胎和第2胎平均產仔數間無顯著差異（P>0.05）。

關鍵詞：蘇姜豬；肝受體類似物質-1（Lrh-I）；聚合酶鏈式反應一單鏈構象多態性（PCR-SSCP）；產仔數

中圖分類號：Q953 文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2015）05-0021-04

肝受體類似物質一1（1iver receptor homolog-1，Lrh-I）是核受體7個亞家族成員（NRO～NR6）中的第5個，該亞家族包含4個不同成員，Lrh-I是其中第2個，故也稱其為NR5A2（nuclear receptor subfamily 5，group A，menlber 2）。Lrh-I是動物機體中一種重要的核受體，Lrh-I基因首次發現于小鼠肝組織，現已在人、大鼠、馬、雞、羊、魚、蛙、牛、豬等生物體內均檢測到，并已確認在動物早期胚胎發育、分化以及物質代謝活動，如膽固醇代謝、膽汁酸動態平衡、激素生成等過程中，Lrh-I基因具有重要作用。

蘇姜豬是以姜曲海豬、楓涇豬、杜洛克豬為親本，經過6個世代繼代選育培育而成的新品種。該品種具有血統來源豐富、繁殖性能良好、肉質性狀優良、適應性強等特點。本研究采用PCR—SSCP方法首次進行蘇姜豬Lrh-I基因核酸序列檢測分析，以期獲得蘇姜豬Lrh-I基因多態性及群體遺傳分布特點，并與產仔數性狀間進行關聯分析，為深入研究Lrh-I基因的結構特點及其與動物繁殖性狀間的關系提供理論依據。

1.材料與方法

1.1試驗材料

隨機選取50頭經產蘇姜種母豬，用酚-氯仿抽提法提取耳組織DNA，超純水稀釋至100ng/ul，-20℃保存備用。

1.2Lrh-I引物設計

根據GenBank數據庫中豬Lrh-I基因序列JQ_527656.1、NM_001267893.1、NC_010452.3為依據，采用Primer premiers5.0軟件設計2對引物（表1）。

1.3PCR—SSCP檢測

依據表1中不同引物退火溫度，進行樣本Lrh-I基因PCR擴增。取5uL PCR產物和10uL變性劑[98%甲酰胺、0.025%二甲苯青、10%甘油、10 mmol/L EDTA（pH值8.O）、0.025%溴酚藍]，98℃變性10min，迅速冰浴10min。變性后產物在8%非變性聚丙烯酰胺：甲又雙丙烯酰胺（29：1）凝膠中電泳，之后銀染顯帶，拍照分析。

1.4PCR產物測序

經SSCP電泳后，將不同條帶型PCR產物送至上?；瞪锛夹g有限公司測序。

1.5統計分析

試驗數據用SPSS13.0統計軟件進行差異顯著性檢驗分析。依據哈迪一溫伯格定律檢測相關基因頻率群體平衡性。

2.結果與分析

2.1Lrh-I基因2對引物PCR擴增結果

Lrh-I基因2對引物P1和P2 PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳（圖1），結果顯示條帶清晰，表明該2對引物的PCR擴增特異性好。將PCR擴增產物測序后，進行NCBI數據庫BLAST分析，結果顯示擴增產物與豬，Lrh-I基因序列有高度相似性，引物Pl和P2 PCR擴增產物與JQ_773337.1、JQ_627655.1和NM_001267893.1序列覆蓋區相似度分別為99%和98%，表明本試驗所擴增的核酸序列在，Lrh-I基因區。

2.2SSCP分析

對Lrh-I基因2對引物PCR產物進行SSCP分析，結果顯示均存在多態性。引物P1、P2 PCR擴增產物分別存在7、2種SSCP條帶類型（圖2、圖3）。

2.3SSCP不同類型核酸序列分析

2.3.1引物P1 PCR-SSCP不同條帶類型核酸序列分析將SSCP不同條帶類型的引物Pl PCR擴增產物序列與NC_010452.3進行比對分析，結果顯示，不同SSCP條帶類型核酸序列主要在NC-010452.3序列相應的27287662、27287593、27287535和27287511這4個位點存在堿基差異。通過將引物P1 PCR擴增產物與NM_001267893.1序列進行BLAST分析，可知27287662與27287593位點處于CDS區。27287662和27287593位點堿基突變分別為A-G和c-T，且均為同義突變；27287535和2728511位點則均為A-G的突變（表2）。

2.3.2引物P2 PCR—SSCP不同基因型核酸序列分析將引物P2 PCR擴增的不同基因型產物序列與NC_010452.3進行比對分析，結果顯示，在NC-010452.3序列對應的27423038位存在A-C的同義突變（表3）。

2.3.3蘇姜豬，Lrh-I基因群體遺傳分析蘇姜豬，Lrh-I基因引物P1和P2擴增區不同SSCP型頻率以及基因頻率見表4至表6，結果顯示，引物P1擴增區SSCP-1和SSCP-5型所占比率較高，在4個堿基突變位點中僅27287662位點存在3種基因型，另3個位點均缺少1種純合基因型。根據哈迪一溫伯格定律，對蘇姜豬，Lrh-I基因引物P1和P2擴增區進行基因群體平衡性x檢驗，結果表明，引物P1擴增區27287662、27287593、27287535位點基因分布符合哈迪一溫伯格定律，處于群體平衡狀態（P>0.05），27287511位點基因分布不符合哈迪一溫伯格定律，處于群體不平衡狀態（P<0.05）；引物P2擴增區基因分布符合哈迪一溫伯格定律，處于群體平衡狀態（P>0.05）（表7）。

2.3.4Lrh-I基因不同SSCP型與產仔數間相關性分析根據生產記錄對蘇姜豬進行Lrh-I基因不同SSCP型產仔數統計分析（表8），結果表明，蘇姜豬，Lrh-I基因P1和P2擴增區不同SSCP型第1胎和第2胎平均產仔數均無顯著差異（P>0.05）。

3.結論與討論

Lrh-I基因屬核受體亞家族，主要表達于動物的肝臟、性腺、胰腺等組織。Lrh-I具有調節膽汁酸的平衡、類固醇合成、膽固醇逆轉運以及早期胚胎發育等功能。最近有研究認為磷脂質是Lrh-I潛在的配體。與其他配體激活轉錄因子的核受體家族成員一樣，Lrh-I具有保守的DNA結合域DBD（nuclear receptor-DNA binding domain-like）、可變的N末端、絞鏈區和一個C端配體結合域LBD（nuclear receptor-lingand binding domain_Lrh-1）。

豬Lrh-I基因位于10號染色體，其編碼區CDS（codingsequences）共有1332個堿基，可翻譯成含443個氨基酸的蛋白質，2個保守結合域DBD、LBD分別位于第40～80、203～443氨基酸區，DBD區含2個C4型鋅指結構，LBD區含有3個特殊識別位：第235～240、242～244、321、422～424、426～428、430～431位氨基酸為同型二聚體界面位，也為多肽結合位；第244、247～248、284～285、288、292、307、318、321～323、326、329～330、415、418～419、422位氨基酸為配體結合位，也為化學結合位；第256、259、263、273、276～277、280～281、432～433、436～437位氨基酸為輔阻遏物識別位。

本研究通過PCR—SSCP方法，首次對蘇姜豬，Lrh-I基因序列LBD區部分序列進行了多態性檢測。引物P1 PCR擴增區共檢測到7種SSCP條帶型，其中相對較高的條帶型為SSCP一1型（24%）和SSCP一5型（26%），表明在蘇姜豬群體中該區段的堿基差異較大，這可能與其源于多個豬品種的培育史有關。對不同SSCP型樣本核酸序列檢測分析，結果顯示共存在4處堿基突變位點，分別對應于NC_010452.3序列的27287662、27287593、27287535和27287511位點，其中前2個位點處于豬Lrh-I基因CDS區。經分析，在27287662位點存在A—G的堿基突變，位于密碼子的最后1位，即由原UUU密碼子變為UUC，相對應的氨基酸均為苯丙氨酸，處于豬Lrh-I蛋白質氨基酸組成的第345位，未在特殊功能結合位；在27287593位點為c—T的堿基突變，也發生在密碼子的最后1位，即由原GCG密碼子變為GCA，相對應的氨基酸均為丙氨酸，處于豬Lrh-1蛋白質氨基酸組成的第322位，位于配體結合位。然而，這2處堿基突變均為同義突變，對Lrh-I結構及功能不會造成影響。引物P2PCR擴增區共檢測到2種SSCP條帶類型（AA型和AB型），其中AA型（84%）所占比例遠高于AB型（16%）。通過檢測2種類型樣本的核酸序列得知，在對應的NC_010452.3序列27423038位存在A-c的堿基突變，該堿基位于密碼子第3位，使原密碼子CGG變為CGU，相對應的氨基酸均為精氨酸，屬同義突變，未對Lrh-I基因結構及功能造成影響，進一步體現Lrh-I基因LBD區域的保守性和功能重要性Lrh-I。對于LBD區其他未擴增區段以及DBD區核酸序列是否也存在堿基突變情況，將在日后的研究中進一步檢測分析。

蘇姜豬群體中引物P1擴增區4個突變位點僅27287662位點存在3種基因型（CC、CD、DD），其他3個突變位點均缺少1種純合型，引物P2擴增區也缺少1種純合型。經基因群體遺傳平衡分析，除引物P1擴增區27287511位點未達群體平衡（P<0.05）外，其他4個堿基突變位點均達群體平衡（P>0.05），此現象可能與蘇姜豬有針對性的選擇培育有關，但在群體中未檢測到部分位點的純合型個體則可能與其他基因或性狀存在關聯影響，有待深入研究。

Lrh-I基因在動物卵巢卵泡顆粒細胞和妊娠黃體細胞中通過調控SR-BI，和CYPl9基因的表達，進而調控雌激素的生物合成；敲除小鼠Lrh-I基因，可影響卵巢卵泡排卯功能。這些現象均表明Lrh-I因與動物繁殖機能有重要相關性。本研究將Lrh-I基因引物Pl和P2擴增區不同SSCP類型與蘇姜豬產仔數進行關聯分析，結果表明，不同SSCP類型與第1、2胎產仔數間均無顯著影響（P>O.05）。但從引物P1擴增區4個堿基突變位點的雜合情況看，蘇姜豬第1胎SSCP一7型平均產仔數相對最低，為8.20±2.49頭，其4個堿基突變位點均為純合型，而其他SSCP型至少有1個堿基突變位點為雜合型，表明引物P1擴增區相應堿基突變位點的雜合可能有助于產仔數性狀的提升。引物P2擴增區2種基因型在第1、2胎產仔數性狀上也未達到顯著差異水平（P>0.05），但相對而言，蘇姜豬AA型平均產仔數高于AB型，表明27423038位點堿基的突變可能不利于產仔數性狀的提升.