米易雞ADSL基因第2和第9外顯子多態性與肌苷酸含量的關聯

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摘要：為了檢測米易雞ADSL基因第2、第9外顯子的單核苷酸多態性并分析該多態性與胸肌肌苷酸含量的關聯性，以四川省優質地方雞種米易雞為研究對象，采用高效液相色譜測定米易雞胸肌肌肉肌苷酸的含量，并運用測序技術測定了ADSL基因第2、第9外顯子的單核苷酸多態性。結果表明：ADSL基因在外顯子2（A3713G、C3797T），外顯子9（C10191T）處出現3個SNP位點，變異引起相應的氨基酸均為同義變異，第2外顯子A3713G位點的基因型為AA、GG、AG型；C3797T位點的基因型為CC、CT、TT型；第9外顯子的C10191T位點的基因型為CC、CT型。經獨立性檢驗，ADSL基因A3713G、C10191T位點變異處于Hardy—Weinberg平衡狀態；應用最小二乘法對基因型與肌苷酸含量進行分析，說明ADSL第9外顯子C10191T SNP位點與IMP含量存在顯著相關性（P<0.05），CT型個體的胸肌肌苷酸含量高于cc型個體，初步推測米易雞中ADSL基因第9外顯子C10151T SNP位點CT型為優勢基因型。

關鍵詞：米易雞；肉質風味；育種改育；肌苷酸（IMP）；ADSL基因；SNP；外顯子2；外顯子9；多態性；相關性

中圖分類號：S831.2 文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2015）05-0029-03

目前國內外的大量研究表明，雞肉內的肌苷酸含量在很大程度上影響其肉質風味及性狀，但是肌苷酸含量又受多種因素的影響，常規選育進展較慢，因此利用與肌苷酸含量相關的候選基因，應用分子標記輔助選擇加快遺傳研究進展是當前較為有效的手段，可以在分子水平對肉雞的肉質風味進行育種改良。肌苷酸（inosine monophosphate，IMP）是衡量肌肉肉質風味性狀的重要指標之一，在體內肌苷酸從頭合成過程涉及10種關鍵酶，這10種關鍵酶由5個基因編碼，即（；PAT基因、AIRC基因、ADSL基因、GARS-AIRS-ART基因、PURH基因。其中ADSL基因是嘌呤核苷酸合成過程中的關鍵酶之一，催化2個重要反應：（1）由氨基咪唑琥珀基氨甲酰核苷酸（sACIAR）生成氨基咪唑氨甲酰核苷酸（AICAR）的反應；（2）由腺苷酸琥珀酸生成腺苷酸單磷酸的反應，這2個反應對于最終的肌肉肌苷酸含量具有重要的影響。Aimi等克隆了雞ADSL基因的cDNA全長序列并將其定位于1號染色體上，長15 593 bp，包含13個外顯子和12個內含子，轉錄為長1520bp的mRNA（NM-205529.1），翻譯成含有459個氨基酸的蛋白質序列（NP-990860.1）。季從亮以ADSL基因作為IMP含量的候選基因，對5'側翼序列、所有外顯子和部分內含子單核苷酸多態位點進行檢測，共檢測到5個SNP位點，并發現部分突變位點與胸肌肌苷酸含量相關。

“米易雞”是四川省的優良地方雞種之一，其體型較大，具有早期生長速度快、肉用性能較好、性情溫順、便于飼養管理、肉質風味佳等優點。為研究米易雞肉質風味好的特點，本研究擬采用測序技術檢測米易雞ADSL基因外顯子9的單核苷酸多態性，并與米易雞肌苷酸含量問進行關聯研究，以探討在米易雞內ADSL基因第2、第9外顯子的多態性與肌苷酸含量問的關系，為米易雞的優良肉質風味選育提供理論依據。

1.材料與方法

1.1試驗動物

于四川省攀枝花市米易雞專業養殖戶購入脫溫雞苗64羽（公母各半），全階段由專人管理，單籠飼養，管理和營養水平一致，自由飲食。分別在81、119、153、210d進行屠宰性能測定，真空采血管（EDTA·K2抗凝，江蘇康健醫療用品有限公司生產）翅下靜脈采血，每羽采血約2mL，置于-20℃冷凍保存備用。屠宰時同時采集胸肌和腿肌，-80℃保存備用。

1.2試驗方法

1.2.1血液中DNA提取和檢測

用AXYGEN血液基因組（Axygen公司生產）DNA提取試劑盒提取血樣中的基因組DNA，經PCR儀（型號：AG22331 Hamburg，德國Eppendoff公司生產）擴增、瓊脂糖凝膠電泳（電泳儀型號：DYCP-31DN型，北京六一儀器廠生產）和紫外一可見分光光度計（型號：Cary 50，美國Varian公司生產）檢測純度，-20℃保存備用。

1.2.2引物設計、PCR擴增及測序

根據筆者所在實驗室對ADSL基因的研究結果及ADSL基因信息（GenBank登錄號：AY665559），用Primer5.0設計特異性引物，由上海英駿生物技術有限公司合成，擴增該基因含有SNP位點的第2、第9外顯子特異性序列，引物序列及產物片段長度見表1。

PCR擴增體系（25uL）為：9.5uL超純水（超純水系統型號：艾柯AKHL—III一24，成都康寧實驗專用純水設備廠生產）、各1μL上下游引物（10μL，濃度10umol/L，上海英駿生物技術有限公司合成）、1uL DNA模板（100ug/uL）、12.5uLMaster Mix[天根生化科技（北京）有限公司]。

PCR擴增程序為：94℃預變性5min；94℃變性30s，52℃/57℃復性30s，72℃延伸30s，30個循環；72℃延伸7min。擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物的亮度和純度。根據瓊脂糖凝皎電泳檢測結果，將所有PCR產物送至上海英駿生物技術有限公司進行雙向序列測定。

1.2.3肌苷酸含量的測定參照陳國宏等的高效液相色譜法”叫測定肌肉肌苷酸含量。

2.結果與分析

2.1雞基因組DNA抽提結果

從試驗雞群血液中提取基因組DNA，使用1.5%瓊脂糖凝皎電泳檢測，與相同上樣量的DL2000 marker[天根生化科技（北京）有限公司]比較。圖1結果顯示，條帶清晰明亮，大約40kb]，且無掃尾現象，濃度較均勻，表明所提取DNA質量較好，含雜質較少，完全符合PCR試驗要求。

2.2 PCR擴增結果

利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分別對ADSL基因第2、第9外顯子擴增片段進行檢測，由圖2、圖3可見，在279、255 bp處分別呈現出1條特異性的條帶，表明引物特異性較好。

2.3測序結果

將PCR擴增的特異片段進行測序，通過測序反應檢測到米易雞ADSL基因第2外顯子存在A3713G、C3797T變異，第9外顯子存在C10191T變異，但都未引起相應氨基酸的變異。由圖4、圖5、圖6的測序結果可知，米易雞ADSL基因第2外顯子A3713G位點的基因型為AA、GG、AG型；C3797T位點的基因型為CC、CT、TT型；第9外顯子的C10191T位點的基因型為CC、CT型。

2.4 ADSL基因第2、第9外顯子突變位點的基因和基因型頻率分析

統計ADSL基因第2、第9外顯子的變異在米易雞中的基因頻率、基因型頻率及檢驗分析結果。由表2結果可見：米易雞中ADSL基因第2外顯子A3713G、第9外顯子C10191T的SNP位點在試驗群體中均處于Hardy-Weinberg平衡狀態2.5 ADSL基因第2、第9外顯子的SNP位點的基因型與胸肌IMP含量的相關性分析

對ADSL基因第2外顯子A3713G、C3797T和第9外顯子C10191T SNP位點的基因型和IMP含量進行差異顯著性檢驗。表3結果表明：ADSL基因第2外顯子中的各基因型與胸肌IMP含量差異都不顯著；ADSL基因外顯子9（C10191T）中CT雜合子個體胸肌的IMP含量最高，顯著高于cc型個體胸肌的IMP含量（P

3.討論與結論

3.1 ADSL基因的多態位點

季從亮掃描了ADSL基因含5'側翼序列在內的所有的13個外顯子以及部分內含子序列，并進行了SNP位點檢測，結果共檢測出5個SNP位點，其中2個位于外顯子區域，3個位于內含子區域，結果僅有外顯子9處存在C9839A突變為非同義突變，導致了甘氨酰胺核苷酸合成酶氨基酸序列的第173處發生氨基酸的變異：脯氨酸（Pro）變異為蘇氨酸（Thr）。張學余等對隱性白羽雞、絲羽烏骨雞、蕭山雞、白耳雞、藏雞ADSL基因的外顯子9的研究發現了相同突變位點，并發現可引起氨基酸變異。而本研究通過對米易雞的ADSL基因外顯子9的檢測發現，在C10191T處發生突變，翻譯氨基酸序列后比對發現第286處的亮氨酸（Leu）發生變異，表明該突變為同義突變。龔琳琳對皋雞、安卡雞、文昌雞、隱性白羽肉雞4個群體的ADSL基因外顯子9的檢測中也得到了同樣的結果。

束婧婷等發現，在ADSL基因外顯子2的A3713G、C3484T處發生了突變，但2個突變位點都沒有引起相應的氨基酸發生改變。本研究也是在外顯子2的A3713G、C3797T處檢測到突變位點，分別翻譯甘氨酰胺核苷酸合成酶氨基酸序列后比對發現，在第59處的亮氨酸（Leu）和第87處的絲氨酸（ser）都未發生變化，表明2種突變都是同義突變，都沒有引起相應的氨基酸變異。

3.2ADSL基因第2、第9外顯子SNP位點的基因型和胸肌IMP含量的相關性

張學余等在ADSL基因外顯子9的C9839A處發現突變，通過對5個雞種該突變位點的基因型與肌苷酸含量的相關性分析表明：在5個雞群體中的基因型分布差異顯著，除了蕭山雞與絲羽烏骨雞之間基因型分布差異不顯著之外，其余各雞種兩兩之間均存在顯著或極顯著的基因型分布差異（P<0.05或P<0.01），初步推測該位點的基因型頻率分布與品種有關，但進一步方差分析并沒有顯示出該位點的多態性與胸肌的IMP含量之間存在關聯。束靖婷等通過對ADSL外顯子2的C3484T突變位點與肌苷酸含量的相關性分析，表明ADSL基因中TT型個體胸肌IMP含量較cc型高出O.880mg/g，達到極顯著水平（P<0.01），TT型個體IMP含量較CT型高出0.758mg/g，達到顯著水平（P<..05），CT型個體IMP含量稍高于CC型，但二者之間差異不顯著。

而本研究對米易雞ADSL基因第2、第9外顯子SNP位點研究結果表明，雖然3個突變位點都沒有引起相應的氨基酸變異，但其中外顯子9的C10191T突變位點中的CT雜合子個體胸肌的IMP含量最高且都高于其他基因型個體胸肌的IMP含量，達到顯著水平（P<0.05），說明該位點的變異對胸肌的IMP含量變化有較顯著的影響。米易雞中ADSL基因第9外顯子C/T（C10191T）sNP位點CT型為優勢基因型，雖然未檢測到TT型，但是可以推測TT型是C基因突變為T的結果。

由此可見，ADSL基因外顯子9處的基因突變對胸肌IMP含量的影響在不同的雞種之間的表現不完全一致。雞ADSL基因不同外顯子的不同變異，在不同雞種中的變異不盡相同，且與雞胸肌IMP含量之間的調控模式關系也還不清楚；因此，今后有必要選擇具有代表性的雞種，大大增加測定樣本，對ADSL基因的全部變異位點進行掃描，方可弄清ADSL基因對雞胸肌IMP含量之間的調控模式。