玉米紋枯病病菌y—谷氨酰轉肽酶基因克隆與表達分析

劉博　孔婷婷　劉限　高增貴　姚遠　唐琳　何世道

摘要：前期利用In-Fusion SMARTerTM cDNA Library-Construction Kit已完成玉米紋枯病菌WF-9菌株的全長cDNA文庫，并進行EST分析。筆者在此基礎上，將EST片段進行聚類拼接，得到一個長944 bp的序列，根據所得序列開放閱讀框設計引物，克隆得到玉米紋枯病病菌y-谷氨酰轉肽酶基因（GGT）cDNA序列，以生物信息學方法對其序列進行預測分析，并利用real-time PCR分析GGT在立枯絲核菌侵染玉米葉片不同時期的表達特性。結果表明，克隆所得617bp序列與EST序列完全相同，在GenBank進行Blastx同源比對，與gamma—glutamyhranspeptidase（Rhizoctoniasolani AG-3 RhslAP）有85%的同源性。實時熒光定量PCR表明，GGT在立枯絲核菌侵染玉米葉片各個時期均有表達，并存在明顯差異，其中在病菌侵染玉米葉片24 h時表達量最高。

關鍵詞：立枯絲核菌；GGT；基因克??；表達分析

中圖分類號：S435.131.4+9 文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2015）05-0039-03

玉米紋枯病是世界玉米產區廣泛發生、危害嚴重的世界性病害之一。近年來，隨著玉米栽培密度的提高，氮肥用量增加，形成有利于玉米紋枯病發生的小氣候條件，該病在某些地區危害日益嚴重，有逐年加重的趨勢。玉米紋枯病現已成為制約我國玉米持續增產的主要病害。

目前，關于真菌病害相關基因研究較多，杜欣可克隆了玉米紋枯病菌內切多聚半乳糖醛酸酶的基因，用該基因構建了酵母工程菌株，接種玉米葉片出現水浸狀病斑。崔福浩成功克隆了β-1，4-內切纖維素酶基因，用該基因構建了酵母工程菌株，接種試驗表明，該基因可以殺死植物細胞。還有一些與代謝有關的基因已被克隆，Bowyer等發現引起禾谷類全蝕病的禾頂囊殼菌（Gaeuman-nomyces gramins）產生燕麥素酶分解燕麥根表皮細胞內的皂角苷燕麥素，編碼該酶的基因突變后禾頂囊殼菌也就失去了對燕麥的致病力。關于玉米紋枯病菌y-谷氨酰轉肽酶基因（Gamma一對utamyltranspeptida-se，GGT）未見報道，y-谷氨酰轉肽酶是一種催化肽基轉移作用的酶，在H pylori誘導的線粒體介導的程序性細胞死亡中，主要是通過誘導線粒體釋放細胞色素c進入細胞質和激活Caspase家族成員起作用，H pylori y-谷氨酰轉肽酶（y—glutamyl transpeptidase，GGT）在分泌和成熟后通過離子鍵與細胞膜結合，將細菌和宿主細胞直接連接起來。y-谷氨酰轉肽酶廣泛存在于原核和真核細胞中，在動物體內主要存在于腎、肝、胰等臟器，在谷胱苷肽的新陳代謝中起到了重要作用。

筆者所在實驗室構建了立枯絲核菌cDNA文庫，獲得了329個高質量ESTs序列。為了明確GGT在病菌侵染過程中的表達情況，通過對EST數據進行分析，根據所得序列設計引物，克隆了立枯絲核菌GGT，驗證了前期EST序列測序結果。在此基礎上，通過測定該基因在病原菌侵染過程中的表達量，探明該病原菌與寄主互作過程中的基因表達規律，為下一步研究侵染機制奠定基礎。

1.材料與方法

1.1材料

玉米立枯絲核菌（Rhizoctonia solani AG-IlA）菌株WF-9，沈陽農業大學植物免疫研究所保存。立枯絲核菌在PDA培養基培養3d，刮取菌絲50～100mg，用于RNA提取、克隆。用離體葉片接種法，將培養3d的立枯絲核菌菌餅，放在玉米3葉1心期苗的葉片上進行接菌，分別取0、12、18、24、30、42、54、72h互作玉米葉片（水漬狀發病處）100mg，用于各個侵染時期基因表達量分析。所有樣品經液氮速凍，保存于-80℃備用。

1.2 RNA提取及cDNA第一鏈的合成

提取菌株WF-9生長第3天樣品和0、12、18、24、30、42、54、72h互作玉米葉片總RNA，參照TaKaRa RNA提取試劑盒說明提取，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質量，使用Thermo公司Nano Drop ND 1000超微量分光光度計測定濃度，使用TaKaRa公司反轉錄試劑盒合成cDNA第一鏈。

1.3立枯絲核菌GGT的克隆

筆者所在實驗室已經構建了玉米立枯絲核菌AG-1-IA的全長cDNA文庫，并進行了全長cDNA的隨機測序。在隨機測序中，分離出GGT EST片段，通過軟件拼接，得到長944 bp的基因，包含完整開放閱讀框。本試驗根據所得序列開放閱讀框，利用軟件primer premier 5.0設計特異性引物c06-f：5'-CACGCATACTCCCGACTACT-3和c06-r：5-GCAACACCATFCTFCCTFGA-3。以eDNA為模板進行PCR擴增，程序為95℃ 4min；95℃45s，54℃ 45s，72℃ 1min，35個循環；72℃ 10min，4℃永久保存。PCR產物用天根切膠回收試劑盒回收，并與pMDl9-T載體（TaKaRa，日本）連接，轉化大腸桿菌感受態細胞，挑取陽性克隆送上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。

1.4GGT序列及系統發育分析

利用軟件包DNASTAR識別可讀框、推測氨基酸序列、預測等電點和分子量。同源搜索Blast分析在NCBI的網頁（http：//www.ncbi.nlnl.nih.gov/blast/）上完成，用Mega 4.0軟件構建GGT氨基酸系統進化樹。

1.5GGT表達分析

根據獲得的GGT核酸序列設計熒光定量PCR引物C060fr-F：5'-CTATCGCTCAGGCCATFGTT-3'，C060fr-R：5'-ATGCGTCGATCTCCTTGTG-3'；以立枯絲核菌GAPDH（基因登錄號AF339928）為內參基因，設計內參引物GAPDH—F：5'-GGTCGGCAAAGTCATACCAT-3'，GAPDH-R：5'-TCTGCGTCCTTCTTGGAGATA-3'。反應在BIO-RADCFX96熒光定量PCR儀（BIO—RAD，美國）上進行，反應體系為cDNA模板（50mg/uL）2.0uL、上下游引物（10umol/L）各1uL、SYBR@Prenlix Ex TaqⅡ12.5uL和dH2O 8.5uL，每個樣品3個重復。反應程序為95℃ 30s；95 qC 5 s，60 qC 30 s（single），共40個循環；95℃ 1s，65℃15s，95℃（continuous），溶解曲線測定；40℃ 30s。

2.結果與分析

2.1GGT的cDNA克隆

根據cDNA文庫所獲得序列開放閱讀框設計特異性引物，以總RNA反轉錄得到的cDNA為模板，通過PCR擴增到600bp左右GGT的cDNA（圖1）。經測序驗證與EST片段序列一致，說明EST拼接序列結果正確。EST拼接測序得到一個長944 bp的序列，在NCBI進行BLASTx對測序結果進行同源性分析，與ganlnla-glutanlyhranspeptidase（Rhizoctonia-lani AG-3 RhslAP）有85%的同源性。利用NCBI站點的ORF finder進行6種可能的框架分析，發現該cDNA片段有一個完整的開放閱讀框，最長的閱讀框為110-802，長度為693bp，編碼230個氨基酸（圖2）。

2.2同源性分析

根據GGT氨基酸序列，采用BLASTX在NCBI上進行比對，下載了17條GGT同源序列，運用Mega 4.0軟件構建系統進化樹，結果顯示克隆GGT與立枯絲核菌AG-3融合群同源性最近（圖3）。

2.3GGT在侵染各個時期表達差異分析

利用實時熒光定量PCR（real-time PCR）技術，以立枯絲核菌GAPDH為內參，分析了GGT在立枯絲核菌不同侵染時間點（O、12、18、24、30、42、54、72 h）的表達情況。結果表明，GGT在立枯絲核菌侵染的各個時間點均有表達，但表達量存在明顯差異，在侵染12、18h時可能由于玉米自身防衛反應，GGT表達量明顯下調；而在24 h，GGT的表達量達到最高，可能是立枯絲核菌在寄主組織內迅速擴展，導致玉米葉片細胞開始程序性死亡，GGT的表達量達到最大；侵染54、72h表達量下降到相對平穩狀態，可能是由于寄主大面積凋亡，病原與寄主互作概率減少造成的（圖4）。

3.討論

GGT是谷氨酰循環中的關鍵酶，可特異性催化y-谷氨?；霓D移反應。GGT具有誘導細胞凋亡的活性，目前被廣泛接受的觀點是線粒體在凋亡的調節中起到了關鍵的作用。GGT對細胞的基本功能是線粒體結構的維護，對膜的完整性及細胞分化和發育具有影響。GGT在真菌、植物細胞中代謝作用一直被忽略。在哺乳動物系統中，該酶已被反復使用，涉及谷胱甘肽重要的抗氧化響應功能，并與半胱氨酸輸送到組織中。敲除GGT活性基因的小鼠有異常發育和早期死亡。為了進一步弄清Rhizoctonia solani GGT在細胞凋亡中的作用及探索Rhizoctonia solani的侵染機制。本試驗采用RT—PCR、基因克隆和核酸測序技術首次獲得R.solaniAG-IlA的GGT核酸序列，驗證了前期EST序列測序的結果，EST拼接測序得到一個長944bp的序列，開放閱讀框為110～802，長度為693 bp，編碼230個氨基酸。相對分子量24.7ku，理論等電點4.68。為后續的功能研究、蛋白制備及其抗體研制提供了良好的試驗材料。

經序列比對結果顯示，本研究克隆得到的GGT與Rhizoc-tonga solani AG-3 RhslAP的GGT氨基酸同源性最高，達到85%；系統發育樹構建結果顯示與立枯絲核菌AG-3融合群同源性最近。后期利用real-time PCR分析GGT在立枯絲核菌侵染玉米葉片各個時間點的表達特性，表明GGT在立枯絲核菌侵染的各個時間點均有表達，但表達量存在明顯差異，其中在病菌侵染玉米葉片24h時表達量最高。本研究只對玉米紋枯病菌y-谷氨酰轉肽酶基因（GGT）進行了克隆，對病菌侵染玉米葉片不同時期的表達量進行了分析。GGT是否參與致病，還需進一步研究。