巴戟天薄層色譜鑒別用對照提取物的研制與應用

林錦鋒　楊志業　李曼莎等

[摘要] 目的 研制薄層色譜鑒別用巴戟天對照提取物，以解決對照藥材的局限性。 方法 從原料選定、制備工藝研究、穩定性影響因素考察等方面探討薄層色譜鑒別用巴戟天對照提取物的研究思路，并比較巴戟天對照藥材與對照提取物在薄層鑒別中的應用結果。 結果 巴戟天薄層鑒別用對照提取物的提取條件：巴戟天粗粉加20倍70%乙醇，加熱回流提取，提取2次，每次1 h。該對照提取物替代對照藥材應用于巴戟天及其成方制劑中的薄層鑒別效果一致。 結論 本研究制備的巴戟天薄層鑒別用對照提取物，可以替代巴戟天對照藥材用于巴戟天及其成方制劑的質量控制分析。

[關鍵詞] 巴戟天；薄層色譜鑒別；對照提取物；質量控制

[中圖分類號] R927.11 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2015）09（c）-0022-05

[Abstract] Objective To develop Morinda officinalis How reference extract for TLC to solve the limitation of reference crude herb. Methods The research strategy of Morinda officinalis How reference extract for TLC was discussed from raw material selected， preparation technology and stability influence factors. Practical results between Morinda officinalis How reference crude drug and reference extract in TLC were compared. Results The extract condition of reference extract used for TLC of Morinda officinalis How was as follows： Morindae officinalis How thick powder was heating reflux extracted with 20 flods of 70% ethanol for two times， 1 hour each time. The reference extract instead of reference crude drug used for TLC of Morindae officinalis How and its historical preparations gained the same effect. Conclusion The reference extract of Morindae officinalis How for TLC prepared by this study can replace Morindae officinalis How reference crude herb to be used for quality control analysis of Morindae officinalis How and its historical preparation.

[Key words] Morindae officinalis How； TLC identification； Reference extract； Quality control

巴戟天為茜草科植物巴戟天Morinda officinalis How的干燥根，始載于《神農本草經》，列為上品，為較常用的中藥，有補腎壯陽、強筋骨、祛風濕的作用，可用于陽痿遺精、宮冷不孕、月經不調、小腹冷痛、風濕痹痛、筋骨痿軟[1-5]。其以肉質根入藥，是我國著名的四大南藥之一，在中醫藥處方中應用廣泛，在我國南方地區以及港澳臺地區還作為常用的食療補品，為我國主要出口藥材之一[6]。

目前，在《中國藥典》及國家、地方的其他藥材和成藥標準中，主要采用對照藥材和中藥單體成分對照品作為薄層色譜鑒別項的對照物質，這種模式存在如下局限性：①對照藥材品種有的黏度大難以粉碎均勻，粉碎后的穩定性降低，使用量過大，前處理麻煩或提取得到的供試品溶液含多種成分黏稠而難以點樣等；②單體成分對照品較難獲得，價格高昂且所能控制的成分單一。中藥對照提取物價格低廉、多成分、專屬性高、穩定性好、制備難度低，更符合中藥的自身特點和質量控制要求，已經逐步成為近年來中藥標準物質研究的新方向，黃芪、大黃、肉豆蔻、苦杏仁、龍膽、當歸、川芎、七葉皂苷等中藥對照提取物得到了研制應用[7-14]。

巴戟天屬于含糖較多，不易粉碎均勻，且按《中國藥典》標準提取得到的供試品溶液黏稠不易點樣的品種。為克服上述局限，需要研究制備巴戟天薄層鑒別用對照提取物，并使之可在巴戟天藥材及含巴戟天中成藥的薄層鑒別項檢測中替代巴戟天對照藥材使用。

1 儀器與試藥

樣品：巴戟天藥材樣品5批（經廣東省食品藥品檢驗所林錦鋒副主任中藥師鑒定均為茜草科植物巴戟天Morinda officinalis How的干燥根），樣品信息見表1；巴戟天對照藥材（中國食品藥品檢定研究院，批號：121163-201004）；喘可治注射液（廣州萬正藥業有限公司，批號：12071801）。

儀器設備：數控超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司，KQ-300DE型）、旋轉蒸發儀（Heidolph，LABOROTA 4003）、薄層自動點樣儀（Camag，ATS4）、薄層色譜成像儀（Camag，REPROSTAR 3）、電子天平（Sartorius，CP225D）、恒溫恒濕培養箱（Binder KBF115）、藥物穩定性試驗箱（天津藥典標準儀器廠，WD-1）。

試劑：純水、試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 原料選定

因選取的原料用途是提取薄層色譜鑒別用對照提取物，故有針對性地對收集到的5批樣品進行性狀和薄層色譜鑒別項目的檢測，比較檢測結果，3號樣品綜合質量最優，故選取3號樣品作為研制用原料。

2.2 工藝研究

巴戟天主要含蒽醌類化合物、環烯醚萜類化合物、多糖及低聚糖類、有機酸類等成分[15-17]，研究表明，巴戟天中的蒽醌類化合物具有防治糖尿病、骨質疏松等作用[18]，巴戟天多糖及低聚糖類具有增強免疫活性、抗抑郁、防治骨質疏松和促進雄性小鼠生精等作用[19-21]。本試驗的工藝研究主要以蒽醌類化合物和糖類成分為考察指標。

2.2.1 不同提取溶劑考察 采用乙酸乙酯、乙醇和水3種溶劑進行提取試驗，提取方法：取樣品2 g，分別以乙酸乙酯、乙醇和水3種溶劑各20 mL加熱回流提取1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣用甲醇1 mL溶解后作為供試品溶液。將提取所得的供試品溶液分別按《中國藥典》（2010年版）一部“巴戟天”藥材標準[1]項下的鑒別（2）和原國家食品藥品監督管理局頒布的“喘可治注射液”標準[22]項下鑒別（2）分別進行蒽醌類成分薄層色譜檢測[以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（8∶2∶0.1）為展開劑，展開，晾干，置254 nm紫外光下檢視]和糖類成分薄層色譜檢測[以正丁醇-無水乙醇-水（5∶4∶1）為展開劑，展開，晾干，噴以α-萘酚試液，105℃加熱至斑點顯色清晰]，結果表明，乙醇提取可以兼顧兩種成分類別的提取，乙酸乙酯對蒽醌類成分提取較佳，但對糖類成分提取不佳；水則對糖類成分提取較佳，而對蒽醌類成分提取不佳。因此，初步選定乙醇為巴戟天薄層色譜鑒別用對照提取溶劑。

2.2.2 不同濃度乙醇考察 取樣品5份，每份約5 g，分別以50%、60%、70%、80%、95%共5種不同濃度乙醇為溶劑各50 mL加熱回流提取1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣稱重計算提取效率，并用甲醇5 mL溶解后作為供試品溶液進行蒽醌類成分薄層色譜檢測和糖類成分薄層色譜檢測（色譜方法均同“2.2.1”）。結果70%乙醇提取得率最高（表2），且薄層色譜效果最佳，故確定最佳提取溶劑為70%乙醇。

2.2.3 不同提取方法考察 取樣品2份，每份約5 g，各加70%乙醇50 mL，分別進行加熱回流1 h和超聲提取1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣稱重計算提取得率，并用甲醇5 mL溶解后作為供試品溶液進行蒽醌類成分薄層色譜檢測和糖類成分薄層色譜檢測（色譜方法均同“2.2.1”）。對加熱回流和超聲提取這兩種常用的提取方式進行考察，結果加熱回流提取的得率高于超聲提?。ㄒ姳?），故采用加熱回流的提取方式。

2.2.4 正交試驗考察優化提取時間、次數及溶劑用量 為全面考察提取工藝條件，取樣品6份，每份5 g，以70%乙醇加熱回流提取，選擇溶劑用量（A）、提取時間（B）和提取次數（C）為考察因素，因素A的水平依次為10、15、20倍，因素B的水平依次為0.5、1、2 h，因素C的水平依次為1、2次，選用L6（32×2）正交表安排試驗，以提取得率為考察指標，將結果填入正交試驗表中的結果欄內，并進行直觀分析和方差分析。由表4可知，RC>RA>RB，表明對提取得率的影響從大到小的順序為：提取次數>溶劑用量>提取時間，最佳的試驗方案為：20倍提取溶劑，回流提取2次，每次提取2 h。提取時間的影響最小，故結合直觀分析和實際生產，適當減少提取時間為1 h，即最終確定的提取方案是巴戟天粗粉加20倍70%乙醇，加熱回流提取，提取2次，每次1 h，減壓回收溶劑至干。

2.3 批量制備

取巴戟天藥材10 kg，按確定的提取方案制備，得對照提取物4.48 kg，得率為44.8%。每克提取物相當于2.23 g藥材。

2.4 穩定性影響因素試驗與包裝條件確定

2.4.1 高溫、高濕和強光照射試驗 取樣品按《中國藥典》（2010年版）二部附錄方法[23]進行高溫、高濕和強光照射等穩定性影響因素試驗，10 d后，從性狀看高溫條件下無明顯變化，高濕條件下樣品吸潮成稠膏狀，強光照射下樣品結塊且顏色變深，而薄層色譜鑒別結果均符合規定，與0 d無明顯差異。

2.4.2 氧化破壞試驗 取本品2份，分別用5%、30%過氧化氫溶液進行氧化破壞試驗。在性狀方面經氧化破壞后，2份樣品顏色均發生了明顯變化，薄層色譜鑒別結果顯示，5%過氧化氫溶液破壞后的樣品與0 d樣品無明顯差異，但30%過氧化氫溶液破壞后的樣品則與0 d樣品不一致，說明樣品在強氧化環境下不穩定。

2.4.3 包裝條件的確定 上述穩定性影響因素考察結果表明，影響巴戟天薄層鑒別用對照提取物穩定性的主要因素有光照、濕度和氧化，包裝應避光、密封，避免氧化和吸濕，故擬定該提取物包裝條件為棕色玻璃安瓿瓶密封包裝。

2.5 巴戟天薄層鑒別用對照提取物的應用

2.5.1 代替《中國藥典》巴戟天藥材標準中的對照藥材 取巴戟天藥材粉末2.5 g，加水1 mL使潤濕，再加乙酸乙酯30 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使之溶解后作為供試品溶液。另取巴戟天薄層鑒別用對照提取物1 g、巴戟天對照藥材2.5 g，同法分別制成對照提取物溶液和對照藥材溶液。吸取上述3種溶液各10 μL，分別點于同一塊硅膠GF254薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（8∶2∶0.1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm）下檢視。結果巴戟天藥材樣品、對照提取物和對照藥材色譜結果基本一致（圖1），表明對照提取物可以代替對照藥材在該鑒別中使用。

2.5.2 代替喘可治注射液標準中的對照藥材 取喘可治注射液2 mL，蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。另取巴戟天薄層鑒別用對照提取物0.1 g，加甲醇10 mL超聲處理30 min，濾過，濾液作為對照溶液。再取巴戟天對照藥材0.25 g，加70%乙醇20 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇10 mL使溶解，作為對照藥材溶液。吸取上述3種溶液各5 μL，分別點于同一塊硅膠G薄層板上，以正丁醇-無水乙醇-水（5∶4∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以α-萘酚試液，105℃加熱至斑點顯色清晰。結果對照提取物和對照藥材色譜結果基本一致，喘可治注射液色譜中，在與上述兩種色譜相應的位置上顯相同顏色的斑點（圖2），表明巴戟天對照提取物可以代替對照藥材在該鑒別中使用。

3 討論

3.1 巴戟天對照提取物與巴戟天對照藥材的優劣比較

巴戟天對照藥材的制備相對簡單，但是使用時因其含糖分高而不易粉碎均勻，每次使用時的前處理較麻煩，提取得到的對照藥材溶液較黏稠、不易點樣。巴戟天對照提取物雖制備相對復雜，但均勻性較好，使用時前處理簡單，薄層色譜結果與對照藥材一致，既可以解決單體對照品難以獲得且價格昂貴的問題，又可以達到多指標成分控制的目的，對巴戟天藥材或處方中含巴戟天制劑的質量控制和標準執行都具有十分重要的意義。

3.2 巴戟天對照提取物的穩定性

本研究已經考察了巴戟天對照提取物的穩定性影響因素，并據此給出了包裝條件，但對照提取物分裝后的穩定性有待進一步進行加速穩定性考察或一般穩定性考察，從而確定其合理的使用期限。

3.3 更進一步的研究

本研究所制得的對照提取物可作為定性鑒別用標準物質，后續擬進一步將對照提取物的指標性成分（如耐斯糖）的含量進行標定定值，并考察確定使其均勻性、穩定性能夠滿足要求，將其制成既可用于定性又可用于定量的對照提取物，可替代高成本對照品的使用，降低標準物質的提取和純化制備的成本，從而顯著降低巴戟天藥材及其制劑的質量控制成本。

3.4 中藥對照提取物統一的技術規范

目前，《中國藥典》收載的中藥對照提取物的品種數量有限，其研制工作也沒有統一的技術規范可依。作為標準物質的中藥對照提取物，必須具備相對穩定的物質組成，保證在相同條件下色譜行為的穩定性和可重現性。因此，為了達到這一基本的技術標準，必須由權威部門制訂發布相應的指導原則與技術要求來指導和規范中藥對照提取物的研制。

[參考文獻]

[1] 國家藥典委員會.中國藥典[S].一部.北京：中國醫藥科技出版社，2010：75-76.

[2] 肖培根.新編中藥志[M].一卷.北京：化學工業出版社，2002：236-242.

[3] 況艷，周燦，廖莎，等.巴戟天炮制方法初探[J].西部中醫藥，2014，27（7）：138-140.

[4] 景海漪，史輯，賈天柱.巴戟天的炮制歷史沿革[J].中國藥房，2013，24（27）：2575-2577.

[5] 王馨，李晶，廖一蘭，等.巴戟天水提物對老年癡呆模型大鼠的保護作用研究[J].中國藥房，2013，24（31）：2908-2910.

[6] 陳彩英，詹若挺，陳蔚文.南藥巴戟天源流考證[J].廣州中醫藥大學學報，2009，26（2）：181-184.

[7] 周超，何軼，魯靜，等.黃芪異黃酮對照提取物的制備及其在黃芪藥材含量測定中的應用[J].藥物分析雜志，2014， 34（3）：523-528.

[8] 逄瑜.替代對照品法在中藥大黃及部分含大黃制劑中的質量控制研究[D].北京：中國食品藥品檢定研究院，2014.

[9] 楊志業，李漫莎，林錦鋒，等.肉豆蔻薄層色譜用對照提取物的制備與應用研究[C]//中華中醫藥學會第七次中藥分析學術交流會論文集.廣州：中華中醫藥學會，2014：398-402.

[10] 袁少雄，李向日.苦杏仁對照提取物替代苦杏仁對照藥材的可行性研究[J].世界中醫藥，2015，10（2）：247-251.

[11] 玄敏，程雪梅，王長虹，等.龍膽和堅龍膽對照提取物的制備[J].中成藥，2015，37（4）：746-751.

[12] 席駿鉆，錢怡云，段金廒，等.對照提取物用于當歸藥材質量控制的研究[J].中國中藥雜志，2014，39（19）：3803-3807.

[13] 呂維.川芎薄層鑒別用對照提取物的研究[D].成都：成都中醫藥大學，2014.

[14] 馬玲云，陳紅巖，肖新月，等.標示量值七葉皂苷對照提取物的研制[J].藥物分析雜志，2014，34（7）：1278-1283.

[15] 陳美燕.巴戟天化學成分研究進展[J].云南中醫中藥雜志，2009，30（11）：63-64.

[16] 史輯，姜永糧，賈天柱.巴戟天屬植物化學成分研究進展[J].廣州化工，2009，37（9）：46-51.

[17] 陳紅，陳敏，黃澤豪，等.巴戟天的化學成分研究[J].中國實驗方劑學雜志，2013，19（21）：69-71.

[18] 吳凌鳳.巴戟天藥材的質量評價研究[D].廣州：廣東藥學院，2014：7-8.

[19] 劉亦恒，吳多慶，朱振標，等.巴戟天多糖對去卵巢大鼠骨質疏松癥的防治作用[J].海南醫學，2014，25（20）：2973-2975.

[20] 劉汝銀，岳宗進，包德明.巴戟天多糖對骨質疏松模型大鼠5-HT、VEGF與體內礦物質含量影響研究[J].中國生化藥物雜志，2015，35（4）：59-62.

[21] 李丹青，肖強兵.巴戟天多糖通過p38MARK信號通路促間充質干細胞成骨分化的體外研究[J].中國中醫骨傷科雜志，2015，23（5）：1-4.

[22] WS3-839-（Z-164）-2004（Z）-2012.喘可治注射液[S].北京：國家食品藥品監督管理局，2012.

[23] 國家藥典委員會.中國藥典[S].二部.北京：中國醫藥科技出版社，2010：附錄199-附錄200.

（收稿日期：2015-05-22 本文編輯：李亞聰）