蒙古沙冬青AmDREB2.2基因的克隆與植物表達載體構建

張至瑋等

摘要：從前期建立的蒙古沙冬青[Ammopiptanthus mongolicus（Masxim） Cheng f.]根轉錄本數據庫中克隆得到1個編碼DREB類轉錄因子基因。結果表明，AmDREB2.2基因序列全長1 045 bp，開放閱讀框（ORF）為597 bp，編碼198個氨基酸，具有典型的DREB轉錄因子保守的AP2結構域。實時熒光定量PCR分析表明，該基因能在根、葉中表達，但對干旱、低溫響應不同，AmDREB2.2主要參與根的干旱脅迫應答。在AmDREB2.2基因的編碼區兩端分別加入BamH Ⅰ和Sac Ⅰ酶切位點，雙酶切植物表達載體pPZP212和帶有酶切位點的AmDREB2.2基因PCR產物，成功獲得了AmDREB2.2的植物過表達載體pPZP212-AmDREB2.2。

關鍵詞：蒙古沙冬青[Ammopiptanthus mongolicus（Masxim） Cheng f.]；AmDREB2.2基因；表達特征；植物表達載體

中圖分類號：Q78 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）16-4065-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.16.061

Cloning of AmDREB2.2 Gene of Ammopiptanthus mongolicus and Construction of Its Plant Expression Vector

ZHANG Zhi-wei， LI Zhang-lei， GAO Fei， CAO Yu-zhen， XIA Bo-lin， ZHOU Yi-jun

（College of Life and Environmental Sciences， Minzu University of China， Beijing 100081， China）

Abstract： A new dehydration responsive element binding protein（DREB） transcription factor gene， which was named as AmDREB2.2， was cloned from Ammopiptanthus mongolicus （Masxim.） （cheng f.） root transcriptome database. The full length of the AmDREB2.2 cDNA was 1 045 bp， including a single 597 bp opening reading frame which encoded a 198-amino acid peptide with a conserved AP2 domain. Quantitative real-time PCR analysis revealed that the AmDREB2.2 expressed in leaf and root of A. mongolicus，but there were different expression patterns under drought or low temperature stress respectively， and it could be mainly induced by drought in root. The plant expression vector pPZP212 and AmDREB2.2 with BamH I and Sac I site were digested by these two restriction enzymes， were ligated and recombinant， and then plant expression vector pPZP212-AmDREB2.2 was successfully constructed.

Key words： Ammopiptanthus mongolicus； AmDREB2.2 gene； sequence analysis； expression pattern； plant expression vector

植物中應答逆境脅迫的基因通常按照功能分為兩類，一類是功能基因；另一類是調控基因。轉錄因子基因作為調控基因的一種，可以與真核基因啟動子的順式作用元件結合，從而達到激活或者抑制轉錄的目的[1，2]。目前，已經獲得了多種轉錄因子基因，將其應用于植物抗逆基因工程的研究取得了重要進展[3，4]。其中，對DREB（Dehydration responsive element binding）轉錄因子基因的研究較多[5-7]。DREB轉錄因子屬于AP2/EREBP（Ethylene-responsive element binding protein）家族成員，受干旱、高鹽或低溫誘導表達，其氨基酸序列的N末端具有核定位信號，C末端具有轉錄激活結構域，而位于中部的AP2/EREBP結構域非常保守，由58個氨基酸組成，能形成3個β-折疊和1個α-螺旋，兩個結構都可以結合到DRE元件的核心結構PUCCGAC上[3，8]。研究表明，DREB2轉錄因子基因主要參與調控植物應答干旱、高鹽和熱激脅迫的基因表達[3，9]。

蒙古沙冬青[Ammopiptanthus mongolicus（Masxim） Cheng f.]隸屬豆科沙冬青屬，為中亞荒漠中的孑遺植物，具有極強的耐旱、耐低溫、耐瘠薄等抗逆特性，是集重要科學價值和生態價值于一身的研究材料。近年來，關于蒙古沙冬青的抗逆機理和抗逆基因資源的挖掘受到關注，并取得了重要研究進展[10-14]。本研究以蒙古沙冬青為研究材料，基于實驗室前期建立的蒙古沙冬青根轉錄本數據庫[10]，克隆獲得1個新的DREB類轉錄因子基因，對其結構和逆境表達模式進行了分析，并構建了AmDREB2.2基因的植物表達載體，為進一步通過異源表達驗證AmDREB2.2基因的生物學功能奠定了基礎。endprint

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 蒙古沙冬青種子采自于寧夏回族自治區中衛縣。

1.1.2 菌株和質粒 pPZP212植物表達載體由中央民族大學生命與環境科學學院植物分子生物學實驗室保存、大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α購自北京博邁德科技發展有限公司、pGEM-T載體購自Promega公司。

1.1.3 酶和試劑 Trizol試劑購自Invitrogen公司；FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒和PCR Master Mix購自天根生化科技（北京）有限公司；膠回收試劑盒、質粒小量提取試劑盒購自北京百泰克生物技術有限公司；SYBR Green Supermix和限制性內切酶均購自Thermo公司。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 根據蒙古沙冬青根轉錄本數據庫中獲得的DREB相關基因序列，采用Primer 5.0設計引物，引物P2.2F-A：5′-GCAAGCACATGTTAGCCAAA-3′；P2.2R-A：5′-TCATGAGGATGAAGGAGAGGA-3′擴增目標基因。

根據熒光定量PCR（Quantitative real-time PCR，qRT-PCR）檢測引物的設計原則，設計基因檢測引物和內參引物。引物P2.2F-B：5′-CTGGGGTAGGCACAGAAGAG -3′；P2.2R-B：5′-GCCCAAAACCAGGAAGAAAT-3′擴增目標基因AmDREB2.2片段。用引物PAmeIF1-F：5′-CTGACATGCGCCGTAGGAACG-3′；PAmeIF1-R：5′-CCCTGCTTATGCCAGTCTTTT-3′擴增內參基因AmeIF1。

根據植物表達載體和目標基因的結構特點設計引物，引入BamH Ⅰ 酶切位點，下游加入Sac Ⅰ酶切位點。引物序列為P2.2F-C：5′- CGCGGATCCGCAAGCACATGTTAGCCAAA-3′（劃線部分為BamHⅠ酶切位點）；P2.2R-C：5′-CGCGAGCTCTCATGAGGATGAAGGAGAGGA-3′（劃線部分為SacⅠ酶切位點）。

1.2.2 材料培養與處理 種子萌發培養4周后，用含20% PEG 6 000的1/2 Hoagland營養液澆灌，分別處理1、6、24、72 h，然后4 ℃下分別處理1、3、6、24 h。以未脅迫處理（0 h）為對照，分別取脅迫處理和未經脅迫處理后的植物根和葉片組織，稱量后迅速放入液氮中，用于基因的克隆和表達模式分析。

1.2.3 AmDREB2.2基因的克隆 采用改良的Trizol 法分別提取不同脅迫處理的植物根和葉片組織總RNA[15]，用FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒合成cDNA第一鏈。

以反轉錄得到的未經脅迫處理的cDNA為模板，以P2.2F-A和P2.2R-A為引物進行PCR擴增目標基因，PCR反應體系（40 μL）：2×Pfu PCR Master Mix 20 μL，上、下游引物（10 μmol /L）各1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 17 μL。PCR反應條件為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30個循環；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。膠回收目的片段，與pGEM-T載體連接，轉化E. coli DH5α感受態細胞，挑取單克隆進行菌落PCR檢測，篩選出陽性克隆，送至北京華大基因研究中心測序。

1.2.4 AmDREB2.2基因的生物信息學分析 分別采用相關生物信息學軟件對獲得的蒙古沙冬青編碼DREB基因AmDREB2.2及演繹的氨基酸序列進行分析，具體分析目標及選用的相關軟件見表1。

1.2.5 AmDREB2.2的表達模式分析 采用qRT-PCR對不同脅迫處理下AmDREB2.2在根和葉片中的表達模式進行分析，以未處理（0 h）為對照，以AmeIF1為內參基因。PCR反應體系（10 μL）：2×SYBR Green Supermix 5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.3 μL，稀釋后cDNA模板0.8 μL，ddH2O 3.6 μL。反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，循環40次；55 ℃退火10 s（0.5 ℃/循環），循環81次。采用基因表達相對定量分析，將對照樣本的基因表達量設為1，處理樣本中的基因表達量變化的倍數用2-△△Ct來表示，其中，△△Ct=△Ct（處理）-△Ct（對照），△Ct=Ct（目標基因）-Ct（內參基因），計算在不同處理下基因的表達量，其中每個處理重復3次，每個重復做3個平行。

1.2.6 AmDREB2.2的表達載體構建與鑒定

1）含酶切位點AmDREB2.2基因的擴增。以反轉錄得到的未脅迫處理的cDNA為模板，以P2.2F-C和P2.2R-C為引物進行PCR擴增，反應體系（40 μL）：2×Taq PCR Master Mix 20 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，模板cDNA 1 μL，ddH2O 17 μL。反應條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸35 s，共38個循環；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。膠回收含酶切位點的AmDREB2.2基因，與pGEM-T載體連接，轉化E. coli DH5α感受態細胞，挑取單克隆進行菌落PCR檢測，篩選出陽性克隆，送至北京華大基因研究中心測序。

2）AmDREB2.2表達載體構建與鑒定。以pPZP212作為植物表達載體。以BamHⅠ和SacⅠ雙酶切含有AmDREB2.2的pGEM-T載體和pPZP212表達載體，分別膠純化回收目的片段，將兩個目的片段進行連接，轉化E. coli DH5α，在含有壯觀霉素的LB固體培養基上篩選轉化菌落。提取質粒，用BamHⅠ和SacⅠ進行單酶切和雙酶切驗證。endprint

2 結果與分析

2.1 AmDREB2.2基因全長的克隆

用改良Trizol法提取蒙古沙冬青總RNA，根據蒙古沙冬青根的轉錄本數據庫中搜索獲得的DREB基因序列設計引物，進行PCR擴增，獲得的目的片段大小為600 bp左右，擴增結果與預測結果一致（圖1）。

2.2 AmDREB2.2基因的生物信息學分析

采用DNAMAN 7.0分析獲得的AmDREB2.2基因全長序列，序列全長為1 045 bp，其中5′ UTR 長度為204 bp，3′ UTR長度為244 bp。ORF編碼區長度為597 bp，可編碼198個氨基酸，其等電點（pI）為8.63，分子質量為21 141.54 u。采用NCBI在線分析序列表明，此基因編碼的蛋白質具有典型的AP2結構域，具有11個DNA結合位點，應屬于AP2超家族成員（圖2A）。

二級結構預測表明AmDREB2.1的二級結構主要有3種類型組成：α-螺旋、β-折疊片和無規則卷曲，3種結構所占比例不同，以無規則卷曲為主，β-折疊片較少（圖2B）。

用SignalP 3.0 Server在線軟件分析確定AmDREB2.2不具有信號肽。用PSORT對AmDREB2.2的氨基酸序列進行亞細胞定位分析，推測其定位于細胞核中。采用cNLS Mapper對AmDREB2.2的氨基酸序列進行核定位信號分析，確定其核定位信號序列由27個氨基酸構成。

2.3 AmDREB2.2的系統進化分析

將AmDREB2.2氨基酸序列與相近的12個編碼DREB氨基酸序列進行比對并構建進化樹。結果表明，各序列盡管長短有別，但都具有12個保守的氨基酸，保守氨基酸的存在可能與AP2結構域有關（圖3A）。從構建的系統進化樹可知，在選取的13種DREB蛋白質中，AmDREB2.2與白刺花（Sophora davidii）SdDREB2/AFP89590.1、擬南芥（Arabidopsis thaliana）AtDREB2A、AtDREB2B和AtDREB2C，水稻（Oryza sativa）OsDREB2A/Q0JQF7.1和玉米（Zea mays）ZmDREB2A/ANP_001105876.1聚為一類，其中與SdDREB2最近；與大豆（Glycine max）GmDREB1/AAP47161.1、GmDREB2/ABB36645.1和GmDREB3/ABB36646.1、鹽豆木（Halimodendron halodendron）HhDREB2/ACJ66376.1以及已有文獻報道的2個蒙古沙冬青中編碼DREB序列AmDREB1[16]和AmDREB3[17]關系較遠（圖3B）。

2.4 AmDREB2.2的表達模式分析

2.4.1 干旱脅迫下AmDREB2.1的表達特征 以20% PEG 6 000模擬干旱脅迫處理，采用qRT-PCR研究AmDREB2.2在干旱脅迫下不同組織中的響應特點，結果見圖4A。AmDREB2.2在根和葉片中的逆境表達模式不同，在不同干旱脅迫處理下根中AmDREB2.2表現為迅速上調表達，其中1 h表達量為對照水平的7.84倍，6 h表達量達到最大值，為對照水平的13.45倍；隨著脅迫時間延長，24、72 h表達量呈明顯的回落趨勢，與對照基本相同。而葉中AmDREB2.2在不同干旱脅迫條件下表現為下調表達，24 h表達量顯著下調，為對照水平的0.26；隨著脅迫時間延長，表達量有上升趨勢。

2.4.2 低溫脅迫下AmDREB2.2的表達特征 以4 ℃進行處理，采用qRT-PCR研究AmDREB2.2在低溫脅迫下的響應特點，結果見圖4B。AmDREB2.2在根和葉片中的逆境表達模式相似，與對照相比均表現為下調表達，但未達到顯著水平。

2.5 AmDREB2.2表達載體的構建

以BamHⅠ和SacⅠ雙酶切含有AmDREB2.2的pGEM-T載體和pPZP212表達載體，分別膠純化回收目的片段。將兩個目的片段進行連接，獲得重組載體pPZP212-AmDREB2.2，轉化E. coli DH5α菌株，并在含有抗生素壯觀霉素的LB固體培養基上篩選轉化菌落。以P2.2F-C和P2.2R-C為上、下游引物，以含有重組載體pPZP212-AmDREB2.2的菌液為模板，擴增得到約600 bp的AmDREB2.2特異條帶（圖5A）。從兩個單克隆1和3的菌液中提取質粒進行雙酶切鑒定，結果見圖5B。圖中5B為雙酶切產物，大片段長度約為10 kb，小片段大小約為600 bp；2和3分別為BamHⅠ和SacⅠ的單酶切產物，大小約為10 000 bp；4和5為重組質粒，表明AmDREB2.2表達載體構建成功。

3 小結與討論

植物中的DREB類轉錄因子成員較多，參與不同的逆境脅迫應答，如在擬南芥中，DREB1基因主要受低溫誘導表達，DREB2基因則受干旱、高鹽和高溫誘導表達[1]。蒙古沙冬青為主要生長于中亞荒漠地區惟一的常綠闊葉灌木，具有極強的耐干旱、耐低溫、耐貧瘠、耐受沙埋等特性。本研究從蒙古沙冬青中獲得了1個編碼DREB類轉錄因子基因AmDREB2.2，生物信息學分析表明其編碼蛋白具有典型的DREB 類轉錄因子所共有的保守AP2結構域和保守的氨基酸序列。系統進化分析表明，AmDREB2.2與同為豆科的白刺花SdDREB2親緣關系最近，但與同為豆科的鹽豆木HhDREB2、大豆GmDREB1和GmDREB2以及已經報道的蒙古沙冬青AmDREB1[16]和AmDREB3[17]分屬在不同的進化支上，同科植物以及同種植物不同成員之間的進化關系分析結果提示，這些成員可能存在功能上的差異。

Li等[18]研究了大豆GmDREB不同成員的表達特征發現GmDREBc僅在根中受鹽、干旱和ABA誘導。本研究結果表明，AmDREB2.2在蒙古沙冬青的根和葉片中均能表達，但在不同脅迫條件下，AmDREB2.2在根與葉片的表達模式不同。AmDREB2.2主要在根中受干旱脅迫的強烈誘導，而不受低溫脅迫誘導，表明AmDREB2.2主要參與蒙古沙冬青應答干旱脅迫的反應，且具有組織特異性，僅在根中積極響應，符合DREB2類基因主要受干旱、高鹽和高溫誘導表達的特征。endprint

植物的抗逆性是一個受多基因控制的數量性狀，轉化單一下游耐逆基因僅能在一定程度上提高植物的抗性，存在一定的局限性。而通過超表達轉錄因子可以激活更多的下游靶基因獲得抗逆性，故而被認為是植物抗性基因工程的首選基因。本研究選擇花椰菜花葉病毒（CaMV）35S作為啟動子的pPZP212表達載體，成功構建了重組表達載體pPZP212-AmDREB2.2，為進行異源表達驗證基因功能以及植物抗性基因工程研究奠定了基礎。

參考文獻：

[1] LATA C， PRASAD M. Role of DREBs in regulation of abiotic stress responses in plants[J]. J Exp Bot，2011， 62（14）：4731-4748.

[2] 賈小霞，文國宏，李高峰，等.擬南芥DREB1A基因的克隆與植物表達載體構建[J].甘肅農業科技，2011（6）：18-21.

[3] HUSSAIN S S， KAYANI M A， AMJAD M. Transcription factors as tools to engineer enhanced drought stress tolerance in plants[J].Biotechnol Prog， 2011， 27（2） ： 297-306.

[4] TRAN L S， NISHIYAMA R， YAMAGUCHI-SHINOZAKI K， et al. Potential utilization of NAC transcription factors to enhance abiotic stress tolerance in plants by biotechnological approach[J].GM Crops，2010，1（1）：32-39.

[5] LOPATO S， LANGRIDGE P. Engineering stress tolerance in cereals using DREB/CBF genes： Outcomes， problems and perspectives[R].ISB News Report， 2011.

[6] 劉 強，張貴友，陳受宜.植物轉錄因子的結構與調控作用[J].科學通報，2000，45（14）：1465-1474.

[7] 劉 強，趙南明，YAMAGUCHI S K，等.DREB轉錄因子在提高植物抗逆性中的作用[J].科學通報，2000，45（1）：11-16.

[8] WANG J W， YANG F P， CHEN X Q， et al. Induced expression of DREB transcriptional factor and study on its physiological effects of drought tolerance in transgenic wheat[J].Acta Genetica Sinica， 2006， 33（5）：468-476.

[9] 張 梅，劉 煒，畢玉平.植物DREBs類轉錄因子及其在非生物脅迫中的作用[J].遺傳，2009，31（3）：236-244.

[10] ZHOU Y J， GAO F， LIU R， et al. De novo sequencing and analysis of root transcriptome using 454 pyrosequencing to discover putative genes associated with drought tolerance in Ammopiptanthus mongolicus[J].BMC Genomics， 2012， 13： 266-279.

[11] PANG T， YE C Y， XIA X， et al. De novo sequencing and transcriptome analysis of the desert shrub，Ammopiptanthus mongolicus，during cold acclimation using Illumina/Solexa[J].BMC Genomics， 2013，14：488-503.

[12] GUO H， LI Z， ZHOU M， et al. cDNA-AFLP analysis reveals heat shock proteins play important roles in mediating cold， heat， and drought tolerance in Ammopiptanthus mongolicus[J].Funct Integr Genomics，2014，14（1）：127-133.

[13] WU Y， WEI W， PANG X， et a1.Comparative transcriptome profiling of a desert evergreen shrub，Ammopiptanthus mongolicus， in response to drought and cold stresses[J].BMC Genomics，2014，15：671-687.

[14] WEI Q，KUAI B K， HU P，et al. Ectopic expression of an Ammopiptanthus mongolicus H+-pyrophosphatase gene enhances drought and salt tolerance in Arabidopsis[J].Plant Cell Tiss Organ Cult，2012，110（3）：359-369.

[15] 陳 靜，高 飛，周宜君，等.改良Trizol法提取蒙古沙冬青總RNA[J].生物技術通報，2013 （10）：87-92 .

[16] 楊 杞，肖 飛，高 陽，等.沙冬青CBF/DREB1轉錄因子cDNA的克隆及序列分析[J].基因組學與應用生物學，2009， 28（6）： 1043-1048.

[17] 張 鋒，王學峰，董 博，等.沙冬青AmDREB3基因的克隆及植物表達載體構建[J].內蒙古農業大學學報（自然科學版），2012，33（5-6）：133-137.

[18] LI X P，TIAN A G，LUO G Z， et al. Soybean DRE-binding transcription factors that are responsive to abiotic stresses[J].Theor Appl Genet， 2005，110（8）： 1355-1362.endprint