水化層影響酸酐酶內CO2擴散行為的分子動力學模擬

陳功，盧滇楠，吳建中，劉錚

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水化層影響酸酐酶內CO2擴散行為的分子動力學模擬

陳功1，盧滇楠1，吳建中2，劉錚1

（1工業生物催化教育部重點實驗室（籌），清華大學化工系，北京100084；2Department of Chemical & Environmental Engineering, University of California, Riverside, CA 92521,USA）

氣相中酶分子表面的水化層對其催化行為具有顯著的影響。本文采用全原子分子動力學模擬方法考察了氣相體系碳酸酐酶表面的水化層對酶結構以及CO2在酶分子中擴散行為的影響。首先展現了水分子在酶分子及其活性中心周圍的分布，研究了水化層厚度對于酶結構以及CO2擴散速率的影響；發現最有利于CO2擴散進入酶分子的水化層厚度為0.7 nm。確認了碳酸酐酶內CO2的吸附位點，通過對其開合狀態統計，顯示出碳酸酐酶中CO2擴散通道中的瓶頸位置。上述結果對設計和優化碳酸酐酶催化氣相體系中CO2的吸附和轉化提供了依據和啟示。

碳酸酐酶；CO2；擴散；水化層；吸附位點

引 言

CO2的捕集和轉化技術創新對于其減排和利用具有重要的意義。目前所發展的CO2的捕集方法主要包括吸收、吸附、膜分離等[1]?；瘜W吸收是其中應用最為廣泛的方法，單乙醇胺或其衍生物等是應用最廣泛的吸收劑，其吸收容量大、速度快，但解吸熱高，并存在氨泄漏和污染等風險[2]。自然界中碳酸酐酶催化CO2轉化為HCO-3的轉化數高達104～106s-1，遠遠高于傳統化學吸收法（轉化數約為103～104s-1）[3-4]，如果能夠充分發揮酶對底物的高度選擇性以及酶促反應溫和可控特性的優勢，實現氣相中CO2的直接捕集，則免除CO2溶解到液相的步驟并避免了溶解平衡對于吸收過程的限制，這對于處理低濃度CO2尤為有益。

目前碳酸酐酶尚未在CO2的捕集和轉化中得到工業應用，這其中存在兩個瓶頸問題：一是如何提高碳酸酐酶的穩定性以使其滿足不同實際工況；二是如何合理地使用碳酸酐酶以強化底物分子的擴散?，F代生物工程技術為通過分子改造（如定點突變和定向進化[5]）或者化學修飾（如納米固定化[6-8]）等來提高酶穩定性提供了豐富的技術選擇；而CO2的吸附過程強化則可從熱力學和動力學兩個方面入手優化體系組成和操作過程，提升吸附容量和速度。

碳酸酐酶是一類金屬酶[9]，其中鋅離子處于四面體配位的環境中，是發生CO2轉化反應的活性中心。酶分子表面會存在必需水分子（essential water）來維持酶分子的立體構象[9]。因此CO2從氣相擴散進入碳酸酐酶需依次穿過氣-液相界面、碳酸酐酶-水相界面、進入碳酸酐酶內部孔道、擴散到活性中心部位發生反應。因為產物水溶性優于反應物，所以有利于反應沿著氣相壓力降低的方向進行。近年來碳酸酐酶催化CO2水合反應的機理研究取得了豐富成果[10-15]，相比較而言，對于CO2擴散進入碳酸酐酶的微觀機制研究有待深入。本文采用分子模擬的方法來揭示碳酸酐酶表面水化層對于酶分子結構及CO2擴散過程的影響特性，這對于強化碳酸酐酶催化CO2轉化具有重要意義。

本文首先研究了水分子在碳酸酐酶及其活性位點區域的立體分布，揭示了水化層厚度對于酶分子結構剛/柔特性及對于CO2擴散入碳酸酐酶的影響，發現水化層厚度存在最優值。通過確認CO2擴散所涉及酶分子吸附位點，給出了CO2在碳酸酐酶分子內的擴散通道，通過分析各吸附位點開閉狀態找出了CO2擴散通道中的瓶頸位置。上述分子模擬再現了相關實驗研究結果[16-18]，為碳酸酐酶分子改造、修飾及其應用于CO2的吸收和轉化提供了有益的依據和啟迪。

1 模型與模擬方法

1.1 模型建立

模擬所選用的力場為CHARMM27[19-20]，水分子模型選用TIP3P模型[21]，CO2分子模型來自John Straub[22]，鋅的金屬配位結構用非鍵相互作用表示[23]。碳酸酐酶結構取自pdb數據庫（ID：2CBA[24]），模擬體系初始盒子大小為15 nm×15 nm×15 nm，碳酸酐酶置于盒子質心，在碳酸酐酶表面分別放置0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.3和1.5 nm厚度的水分子層，盒子內再放入5000個CO2分子。

1.2 模擬方法

分子動力學模擬軟件為NAMD[25]。采用NPT系綜和Langevin控溫[26]控壓[27]方法。本文是對氣相催化領域的前期探索，旨在研究高壓下CO2的酶法快速吸收與轉化，故設置模擬壓力為5 MPa，溫度為293 K；此壓力溫度下CO2仍為氣態。模擬過程中，采用周期性的邊界條件。模擬過程先經過100步的能量最小化，然后限制蛋白骨架模擬1 ns，接著模擬50 ns。除了計算CO2聚集位點，其他性質均由后25 ns的模擬數據統計分析得到。模擬步長為2.0 fs。采用particle mesh Eward（PME）方法[28]計算電荷相互作用，其截斷距離為1.2 nm。非鍵范德華力采用12-6 Lennard-Jones勢函數計算，其截斷半徑為1.2 nm。

2 結果與討論

2.1 碳酸酐酶分子內部水分子的分布

采用上述模型首先考察了水分子和CO2分子在碳酸酐酶分子內部和周圍的分布，結果如圖1所示。

由圖1可知，加入到體系中99%以上的水分子均緊緊貼附在碳酸酐酶形成水化層，距酶質心的最遠距離可達到1.5 nm。經計算，其與碳酸酐酶表面氨基側鏈形成的氫鍵平均壽命大于0.03 ns，而純水相中氫鍵平均壽命為0.023 ns，這種氫鍵作用是水化作用的主要來源；經計算其自擴散系數均小于2.44 nm2·ns-1，低于純水中水分子自擴散系數2.923nm2·ns-1，表明由于水分子層與碳酸酐酶親水相互作用較強，導致水分子向氣相主體相擴散受限，這與Berendsen等[29]所觀察到的實驗結果一致。由圖1還可以觀察到，當水分子層厚度為0.5 nm時，水化層已能夠完全覆蓋碳酸酐酶。對CO2而言，隨著水化層厚度增加，能夠進入到距離碳酸酐酶質心1.5 nm以內的CO2分子數目逐漸減少，當水化層厚度超過0.9 nm時，CO2在水化層表面呈現無規分布。

圖2給出了水化層厚度對碳酸酐酶RMSD的影響。隨著水化層厚度的增加，碳酸酐酶RMSD先逐漸降低，當水化層厚度大于0.5 nm 時，碳酸酐酶RMSD不再隨水化層厚度發生顯著變化，即碳酸酐酶結構保持穩定。這首先可歸結為水分子與碳酸酐酶表面結合水所形成的穩定的氫鍵網絡，此外該水分子層還可以消弱CO2通過疏水作用力對碳酸酐酶結構的影響。

圖3給出了鋅離子結合的氧原子（來自水分子）周圍水分子上氫原子的徑向分布函數圖，0.1～1.1表示水化層的厚度（nm）。圖中顯示：位于鋅離子周圍0～1.0 nm的水分子有3～4個峰，這是由碳酸酐酶內部形成質子傳遞鏈的水分子所形成的，表明在氣相中該水鏈能夠穩定存在，具體如左側微觀圖所示，這與水相中碳酸酐酶的理論研究結果一致[10-15]。位于1.0～4.0 nm區域的水分子有1個明顯的峰，隨著體系水分子數增大，這個峰由尖銳變為平緩，表明碳酸酐酶表面水化層厚度增大。根據峰型能夠將該峰劃分為1.0～1.5、1.5～2.0、2.0～3.0 nm三層溶劑化層，而在位于4.0 nm以外所有峰都逐漸衰減為0，進一步說明所模擬的氣相體系中的水分子聚集在碳酸酐酶表面。

圖4(a)表明隨著水化層厚度的增加，水化層中形成了氫鍵網絡，氫鍵數目與水化層厚度分別取對數后線性擬合，擬合度達0.996，其斜率為17.2，說明水分子集中在碳酸酐酶周圍且氫鍵數目隨水化層面積增大而增大，這與圖3的結果相互印證。圖4(b)顯示，隨著水化層厚度增加，碳酸酐酶內部的氫鍵數目減少30%，表明其二級結構的強度逐漸趨近于水相中二級結構。

2.2 水化層厚度對CO2在碳酸酐酶內部擴散的影響

在293 K、5 MPa下考察了CO2吸附量隨水化層厚度的變化，結果如圖5所示。

圖5結果表明隨著水化層厚度的增加，CO2的平衡吸附量隨著水化層厚度的增加由1.7%降低到0.2%。這可能是由于水化層厚度增加，在碳酸酐酶表面形成了緊密的氫鍵網絡，界面張力增加，這使得CO2擴散到碳酸酐酶內部并進而發生吸附的難度增大。

圖6給出了鋅結合水上氧原子與其周圍CO2的氫和氧的徑向分布函數圖，0.1～1.1表示水化層的厚度（nm）。圖6(a)、(c)顯示了進入到碳酸酐酶孔道內的CO2圍繞結合水的分布情況；圖6(b)、(d)顯示了吸附在碳酸酐酶表面的CO2圍繞結合水的分布情況。

在碳酸酐孔道內[圖6(a)、(c)]，CO2的分布密集程度（峰高）不隨水化層厚度的增大而單調升高或降低，而存在著最大值。

當水化層厚度為0.7 nm時，CO2分子在碳酸酐酶的孔道內的分布最多（峰最高），即當水化層厚度為CO2分子直徑的3倍時，CO2最易擴散到碳酸酐酶的孔道。這可能是由于當水化層厚度小于0.7 nm時，碳酸酐酶剛性較大，CO2不易擴散到碳酸酐酶的孔道中。而當水化層厚度大于0.7 nm時，碳酸酐酶表面水化層對于CO2的阻礙作用較強，也對CO2的擴散造成了影響。圖6(b)、(d)結果表明，隨著水化層厚度的增加，CO2的峰型逐漸滯后變寬，說明水化層增厚排斥CO2分子，將其推離碳酸酐酶表面。除此之外，比較圖6(a)、(c)可以發現當水化層厚度為0.7 nm時，O峰裂分為0.33和0.51 nm兩處峰，表明了CO2兩個氧原子距離結合水的氧原子的距離存在差異。

進一步從能量角度分析了CO2與碳酸酐酶的非鍵相互作用，如圖7所示。由圖7可知，碳酸酐酶與CO2的范德華相互作用強于靜電相互作用。而隨著水化層厚度的增加，CO2與碳酸酐酶表面直接接觸的概率降低，導致兩者的相互作用逐漸減小。

圖7 CO2與碳酸酐酶非鍵相互作用

2.3 水化層對吸附位點的影響

為分析水化層對于CO2擴散過程的影響，考察了水化層厚度對于碳酸酐酶表面吸附位點的影響。通過cluster算法得到了在水化層內的碳酸酐酶的63個吸附位點，再通過K-center算法把得到的63個吸附位點根據空間位置的劃分，分為20個粗?；轿稽c，結果如圖8所示。

表1給出了組成這前10個（共20個）吸附位點的氨基酸（即吸附位點0.15 nm以內的氨基酸），吸附位點的序號由距離活性位點結合水的距離由近到遠排序給出。

表1 前10個粗?；轿稽c的氨基酸組成

The adsorption sites are represented by sphere, the colors from red to blue indicates their distances to the active sites are from near to far, cartoon model[30]for carbonic anhydrase

進一步地計算了圖8所顯示的各個吸附位點的開合關閉情況。碳酸酐酶內部各氨基酸中原子大小以范德華半徑計算，如果一個吸附位點能夠保持半徑為0.15 nm的空腔，則該吸附位點在此時刻為“開合”狀態，反之為“關閉”狀態。

圖9給出了最重要的吸附位點1的開合關閉情況隨水化層厚度的變化關系[圖9（a）]及20個吸附位點的總開合關閉率隨水化層厚度的變化關系[圖9（b）]。圖9（a）表明，最重要的第一個吸附位點的開合率小于15%，表明CO2分子由氣相進入到碳酸酐酶孔道內部向最重要的吸附位點cavity 1的擴散是相對較難，是擴散的瓶頸位置。水化層為0.7 nm時的平均開合率為32.5%，為最高。水化層厚度0.7～1.3 nm時的平均開合率為28%以上。但根據圖6來看，0.3～0.9 nm的水化層有利于CO2分子擴散到碳酸酐酶內部孔道，這說明不能僅靠吸附位點的開合關閉情況來判斷水化層對CO2擴散入碳酸酐酶的影響。

綜上所述，水化層厚度增大一方面有利于避免碳酸酐酶結構受到CO2的破壞，打開吸附位點，但當水化層過厚時，水化層中形成的致密水分子網絡導致CO2擴散阻力增大，故存在最優的水化層厚度，在本文模擬的工況下，最適宜的水化層厚度為0.5～0.9 nm。

3 結 論

本文采用全原子分子動力學模擬研究了氣相中CO2擴散進入碳酸酐酶的過程。首先考察了水分子在酶分子周圍內和活性中心的分布，發現氣相體系中水分子緊緊圍繞著碳酸酐酶形成了水化層。進一步地考察了水化層厚度對于碳酸酐酶結構及CO2吸附量的影響，發現最有利于CO2擴散進入酶分子的水化層厚度為0.7 nm。通過分子模擬確認了碳酸酐酶分子內CO2的吸附位點，通過對其開合狀態統計，顯示出碳酸酐酶中CO2的擴散通道及其中的瓶頸位置。上述結果給出了二氧化碳擴散從氣相主體擴散進入碳酸酐酶過程的分子圖景，為強化碳酸酐酶對CO2的吸附和轉化提供了有益的參考和啟示。

符 號 說 明

RMSD——root mean square deviation，方均根偏差 RDF——radial distribution function，徑向分布函數 Elec——electrostatic potential，靜電相互作用勢 VDW——van der Waals potential，范德華相互作用勢

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Molecular dynamics simulation for hydration effect on CO2diffusion in carbonic anhydrase

CHEN Gong1, LU Diannan1, WU Jianzhong2, LIU Zheng1

(Key Laboratory for Industrial BiocatalysisPreparingMinistry of EducationDepartment of Chemical EngineeringTsinghua UniversityBeijingChina;Department of Chemical & Environmental EngineeringUniversity of CaliforniaRiversideCAUSA

The hydration layer of the enzyme in the bulk gas phase has great effects on its catalytic performance. Molecular dynamics (MD) simulations at all-atom level was applied to investigate the effects of the hydration layer thickness on the diffusion of carbon dioxide molecules into the active site of a carbonic anhydrase enzyme from a bulk gas phase. Based on the distribution of water molecules surrounding the carbonic anhydrase enzyme, the effects of the hydration layer thickness on the protein structure and CO2transport from the bulk gas phase to the protein active site was studied. The simulation results suggested an optimal hydration layer thickness of 0.7 nm for CO2diffusion. The CO2adsorption sites were identified, which compose of the diffusion channel inside the carbonic anhydrase. The MD simulation revealed the open states of these adsorption sites, which may be useful to identify the bottleneck position of the diffusion channel. The molecular insight is helpful for design and optimization of carbonic anhydrase, enabling more efficient CO2adsorption and conversion.

carbonic anhydrase; carbon dioxide; diffusion; hydration layer; adsorption sites

2015-06-01.

LU Diannan, ludiannan@ tsinghua.edu.cn; LIU Zheng, liuzheng@mail.tsinghua.edu.cn

10.11949/j.issn.0438-1157.20150773

TQ 021.4

A

0438—1157（2015）08—2903—08

盧滇楠，劉錚。

陳功（1991—），男，博士研究生。

國家自然科學基金項目（21028006）。

015-06-01收到初稿，2015-06-10收到修改稿。

supported by the National Natural Science Foundation of China (21028006).