經兔耳背動脈留置針反復采血后局部血管組織炎性細胞因子表達的實驗研究

王安素 ，羅培芳 ，秦成誠 ，張 莉 ，李茜茜 ，楊 平 ，汪 晨

（1.遵義醫學院附屬醫院a.胸心血管外科；b.護理部；c.小兒內科，貴州 遵義563000；2.遵義醫學院 護理學院，貴州 遵義563000）

【論 著】

經兔耳背動脈留置針反復采血后局部血管組織炎性細胞因子表達的實驗研究

王安素1a，羅培芳1a，秦成誠2，張 莉1b，李茜茜2，楊 平1c，汪 晨2

（1.遵義醫學院附屬醫院a.胸心血管外科；b.護理部；c.小兒內科，貴州 遵義563000；2.遵義醫學院 護理學院，貴州 遵義563000）

目的觀察經兔耳背動脈留置針不同頻率采血，局部血管損傷炎性細胞因子的變化，為臨床動脈留置針的科學規范使用及動脈血管的保護提供動物實驗依據。方法將新西蘭大白兔48只按隨機數字表法隨機分為對照組（n=12）、實驗組A組（n=12）、實驗B組（n=12）、實驗C組（n=12）。對照組經兔耳背動脈留置針使用濃度為125 U/mL肝素液2 mL封管，2次/d。實驗組經兔耳背動脈留置針不同頻率采集血標本，實驗A組共采血64次，實驗B組共采血32次，實驗C組共采血16次，每次采血完畢均用濃度為125 U/mL肝素液2 mL封管。96 h后，對48只大白兔于穿刺點前2 cm處取動脈血管和局部組織的標本，切片行免疫組化，檢測腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-1β、白細胞介素-10的表達。結果腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-1β、白細胞介素-10在實驗A組、實驗B組、實驗C組、對照組的表達均依次減弱，分別比較各組間腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-1β、白細胞介素-10表達的積分光密度值，差異有統計學意義（P均<0.05）。結論兔耳背動脈留置針保留96 h，經留置針處采血頻率越高致腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-1β、白細胞介素-10表達越明顯，說明動脈血管損傷炎癥反應越嚴重。

留置針；動脈血管；炎性細胞因子

經外周動脈留置針采集血標本及進行持續有創血壓監測是臨床醫療救治急危重癥患者的重要手段[1]。經動脈留置針處采集血標本、有創血壓監測能有效減少及避免相關并發癥的發生[2]，現已被廣泛應用于臨床急救領域、心血管外科、重癥監護病房、手術麻醉中[3-4]。臨床工作中發現動脈留置針的長期留置及護理不當亦會導致局部血管內膜受損，發生萎縮甚至壞死，引發動脈炎癥反應的發生。如何做好動脈血管保護，減輕患者的痛苦已成為護理亟待解決的問題。本研究建立兔耳背動脈血管損傷模型，觀察經動脈留置針處不同頻率采血致局部動脈血管及周圍組織中炎性細胞因子的改變，為留置針致動脈血管損傷早期防護提供動物實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 由重慶市中藥研究院實驗研究所提供普通級成年健康新西蘭大白兔48只[生產許可證號 SCXK（渝）2012-0006]，雌雄不限，體質量（2.5±0.5）kg。大白兔均進行適應性喂養2周。飼養條件：室溫15～25℃，相對濕度 40%～70%，自由飲水，分籠飼養。飲食活動正常者于實驗前2 d剪去耳背毛發,使用8%硫化鈉脫毛，用清水擦凈耳背，暴露耳背動脈，確定耳背局部皮膚及血管完好無破損。將實驗動物稱重并按照體質量從輕到重編號，采用隨機數字表法將其分為對照組（n=12），實驗 A 組（n=12），實驗B 組（n=12），實驗 C 組（n=12），各組雌雄和體質量比較差異無統計學意義（P均＞0.05）。

1.2 實驗材料 選取Vialon材料制成BD安全留置針（美國BD公司生產,規格：0.7 mm×19 mm,24 G）、3L透明敷貼 （江西3L醫用制品集團股份有限公司）；昆明綠盟科技有限公司生產：戊巴比妥鈉、硫化鈉；北京Biosynthesis生物公司生產：腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）抗體、白介素-1β（interleukin-1β, IL-1β） 抗體、 白細胞介素-10（interleukin-10,IL-10）抗體北京中杉金橋生物技術有限公司生產兔二步法檢測試劑盒；細胞圖像分析系統（德國徠卡公司生產，型號：LEICA QWIN）。

1.3 方法

1.3.1 動物模型的建立 實驗大白兔用戊巴比妥鈉行腹腔麻醉,劑量為30 mg/kg，麻醉生效、呼吸平穩后用固定箱固定,取耳背動脈距耳尖2～3 cm處為穿刺點,并用甲紫溶液標記。大白兔均選擇右耳背動脈進行留置針穿刺,留置針保留96 h,并經留置針處予不同頻率采集血標本,從而導致留置針對局部動脈血管產生機械刺激性損傷,建立留置針致動脈血管損傷的模型（本實驗已通過遵義醫學院實驗動物倫理委員會倫理審批）。

1.3.2 操作方法 （1）對照組，經兔右耳背動脈進行留置針穿刺，但不經動脈留置針處采血，每天8：00、17：30用濃度為125 U/mL的肝素稀釋液 2 mL封管。（2）實驗組經兔右耳背動脈進行留置針穿刺，并經留置針處不同頻率采集血標本刺激動脈血管，實驗組均于每天 8：00～11：30 和 14：00～17：30 采血。 實驗A組每間隔30 min采血1次，連續4 d，共采血64次；實驗B組每間隔60 min采血1次，連續4 d，共采血32次；實驗C組每間隔120 min采血1次，連續4 d，共采血16次。本實驗所有操作均模擬臨床，操作環境清潔，操作前用三氧消毒機消毒2 h，開窗通風0.5 h，各項操作嚴格遵循無菌操作原則及消毒隔離制度。每次采血之前均用5 mL注射器先抽取1 mL動脈血，再用1 mL注射器采血0.1 mL，每次采血完畢均用濃度為125 U/mL肝素液2 mL封管，所有操作由本研究者進行，并保證48只大白兔每次采血均1次穿刺成功。

1.3.3 標本制作 96 h后大白兔均行腹腔給藥麻醉，以兔耳背動脈穿刺點前2 cm為中心，取2cm×2 cm含動脈血管和局部組織的標本，切片行免疫組化[5]，檢測腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-1β、白細胞介素-10的表達，計算積分光密度值。

l.3.4 統計學方法 使用專業圖像分析ipp 6.0計算積分光密度值，采用 SPSS 18.0進行數據錄入和分析，多組間比較采用方差分析，用SNK法進行兩兩比較，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 各組腫瘤壞死因子-α表達情況的比較 腫瘤壞死因子-α表達在實驗A組、實驗B組、實驗C組、對照組中依次減少,各組腫瘤壞死因子-α表達的積分光密度值比較,差異有統計學意義（P＜0.05）,見表 1。腫瘤壞死因子-α免疫組化染色,著色于炎性細胞、內皮細胞胞漿中，呈淺棕黃色、棕黃色或褐色顆粒。見圖1—圖4。

表1 各組實驗兔耳血管及周圍組織中腫瘤壞死因子-α表達情況的比較（±S，×103）

表1 各組實驗兔耳血管及周圍組織中腫瘤壞死因子-α表達情況的比較（±S，×103）

注：*表示P＜0.05，與實驗組A組比較；△表示P＜0.05，與實驗組B組比較；#表示P＜0.05，與對照組比較

組別 n 腫瘤壞死因子-α表達實驗A組 12 13.387±0.596#實驗B組 12 8.487±0.407*#實驗 C 組 12 3.775±0.254*△#對照組 12 0.423±0.045 F 3252.707 P 0.000

圖1 實驗A組血管及周圍組織中腫瘤壞死因子-α的表達（x100）

圖2 實驗B組血管及周圍組織中腫瘤壞死因子-α的表達（x100）

圖3 實驗C組血管及周圍組織中腫瘤壞死因子-α的表達(x100)

圖4 對照組血管及周圍組織中腫瘤壞死因子-α的表達（x100）

2.2 各組白細胞介素-1β表達情況的比較 白細胞介素-1β表達在實驗A組、實驗B組、實驗C組、對照組中依次減少，各組白細胞介素-1β表達的積分光密度值比較，差異有統計學意義（P<0.05），見表2。白細胞介素-1β表達免疫組化染色,均著色于炎性細胞及內皮細胞胞質和細胞膜，陽性細胞胞質和胞膜可見棕黃色顆粒，見圖5-圖8。

表2 各組實驗兔耳血管及周圍組織中白細胞介素-1β表達情況的比較（±S，×103）

表2 各組實驗兔耳血管及周圍組織中白細胞介素-1β表達情況的比較（±S，×103）

注：*表示P<0.05，與實驗組A組比較；△表示P<0.05，與實驗組B組比較；#表示P<0.05，與對照組比較

組別 n 白細胞介素-1β表達實驗 A 組 12 9.016±0.428#實驗 B 組 12 7.084±0.404*#實驗 C 組 12 2.713±0.260*△#對照組 12 0.393±0.043 F 1956.251 P 0.000

圖5 實驗A組 血管及周圍組織中白細胞介素-1β的表達（x100）

圖6 實驗B組 血管及周圍組織中白細胞介素-1β的表達（x100）

圖7 實驗C組 血管及周圍組織中白細胞介素-1β的表達（x100）

圖8 對照組 血管及周圍組織中白細胞介素-1β的表達（x100）

2.3 各組白細胞介素-10表達情況的比較 白細胞介素-10表達在實驗A組、實驗B組、實驗C組、對照組中依次減少，各組白細胞介素-10表達的積分光密度值比較，差異有統計學意義（P<0.05），見表3。白細胞介素-10免疫組化染色，均著色于浸潤的炎性細胞、內皮細胞胞漿、胞膜，呈棕黃色染色。見圖9—圖12。

表3 各組實驗兔耳血管及周圍組織中白細胞介素-10表達情況的比較（±S，×103）

表3 各組實驗兔耳血管及周圍組織中白細胞介素-10表達情況的比較（±S，×103）

注：*表示P<0.05，與實驗組A組比較；△表示P<0.05，與實驗組B組比較；#表示P<0.05，與對照組比較

組別 n 白細胞介素-10表達實驗 A 組 12 7．456±0.357#實驗 B 組 12 5．573±0.350*#實驗 C 組 12 2.770±0.249*△#對照組 12 0.437±0.040 F 2297.238 P 0.000

圖9 實驗A組 血管及周圍組織中白細胞介素-10的表達（x100）

圖10 實驗B組 血管及周圍組織中白細胞介素-10的表達（x100）

圖11 實驗C組 血管及周圍組織中白細胞介素-10的表達（x100）

圖12 對照組 血管及周圍組織中白細胞介素-10的表達（x100）

3 討論

3.1 經兔耳背動脈留置針采血頻率越高，其耳背血管及周圍組織中促炎因子腫瘤壞死因子-α和白細胞介素-1β表達越明顯 動脈留置針對血管是一種機械刺激損傷，可直接損傷血管內皮細胞，通過留置針采血會對血流形成渦流與湍流，亦會損傷血管內皮細胞。內皮細胞受損使血管的通透性增加，炎性細胞在趨化因子的作用下滲出血管壁致炎性組織引起急性炎癥，炎性反應的重要標志是白細胞浸潤，在炎癥早期，主要以中性粒細胞浸潤為主[6]。大量研究證實，中性粒細胞可釋放腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-1β、干擾素-γ等，在出血和炎癥的刺激下，血管內皮細胞可大量表達白細胞介素-1β。文獻報道[7]白細胞介素-1β、白細胞介素-6和腫瘤壞死因子是介導急性期炎癥反應重要細胞因子。腫瘤壞死因子-α和白細胞介素-1β作為急性期重要的炎癥介質在創傷、炎癥等病理情況下表現為增加,尤其在炎癥反應中的表現尤為明顯。結果顯示，腫瘤壞死因子-α和白細胞介素-1β在血管周圍組織及血管內皮細胞中出現高表達，提示留置針致動脈血管發生急性炎癥反應，血管周圍出現炎性細胞浸潤，血管內皮受到炎癥刺激。腫瘤壞死因子-α損傷血管內皮細胞，引起血管功能紊亂，促使血管損傷及血栓形成；白細胞介素-1β是機體內非?；钴S的促炎細胞因子之一，可誘導刺激機體內皮細胞和白細胞釋放一系列相關炎性介質，從而引導局部組織或全身的炎癥反應[6]。白細胞介素-1β的主要功能與作用包括2方面[8]，一方面當白細胞介素-1β在局部表達濃度比較低時，主要對機體起免疫調節作用；另一方面當其在病變局部表達濃度高時，則引起機體的炎癥反應。結果顯示，腫瘤壞死因子-α和白細胞介素-1β的表達水平在實驗 A組、實驗B組、實驗C組、對照組依次減弱，各組比較均有統計學意義（P＜0.05）。提示采血頻率最高實驗A組，炎性細胞浸潤最明顯，釋放腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-1β最多。腫瘤壞死因子-α越多對血管內皮細胞損傷越重，導致白細胞介素-1β表達相對較高。提示經動脈留置針采血頻率較高，留置針對動脈血管直接發生機械損傷較重，采血對血流形成渦流與湍流損傷血管內皮細胞較重，通透性較高，急性炎癥反應較嚴重。本研究結果與張迅等[9]報道腫瘤壞死因子-α和白細胞介素-1β的表達水平同血管損傷程度呈正相關結果一致。

3.2 經兔耳背動脈留置針采血頻率越高，其耳背血管及周圍組織中抗炎因子白細胞介素-10表達越明顯 炎癥是損傷、抗損傷和修復的統一過程，促炎性反應和抗炎性反應同時存在[6]。白細胞介素-10被認為是體內最重要的抗炎細胞因子，幾乎可以抑制所有的促炎性細胞因子的合成與釋放，對下調炎性反應發揮重要作用。并且能抑制巨噬細胞活化，防止巨噬細胞過度活化對宿主組織產生損傷。白細胞介素-10能從以下幾個方面發揮對血管內皮的保護作用：抑制腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-1β、白細胞介素-6等炎癥細胞因子[10-11]；抑制單核細胞貼壁、黏附分子及趨化因子的產生和功能的發揮；抑制外周血中單核細胞組織因子的表達及活性，從而限制促凝活性。白細胞介素-10的抗炎作用在大量的機體內外及動物實驗中均得到證實，在鼠及靈長類動物的內毒素攻擊模型[12]、缺血再灌注及燒傷動物模型中，白細胞介素-10均有保護作用，通過減弱促炎細胞因子的反應，降低了病死率。本研究結果顯示，白細胞介素-10的表達水平在實驗A組、實驗B組、實驗C組、對照組中依次減弱，各組差異比較均有統計學意義（P＜0.05），提示隨采血頻率增加，機體局部產生白細胞介素-10對抗炎性反應增強。在炎癥反應過程中，促炎因子與抗炎因子相互作用、相互抑制，并持續存在。本實驗研究發現，隨采血頻率增加機體局部產生促炎因子腫瘤壞死因子-α和白細胞介素-1β水平升高，抗炎因子白細胞介素-10也明顯上升，腫瘤壞死因子-α和白細胞介素-1β表達并沒有隨白細胞介素-10抗炎因子增加而減少，甚至促炎因子的上升水平更明顯。究其原因，動脈留置針機械刺激損傷因子持續存在，并且采血頻率越高，刺激損傷越大，機體炎性反應越嚴重。腫瘤壞死因子-α和白細胞介素-1β表達未能得到有效抑制，引起促炎和抗炎失衡；也可能與動物實驗研究時間較短,白細胞介素-10的合成晚于促炎性細胞因子有關。

4 小結

經兔耳背動脈留置針保留96 h并經留置針處采血頻率最高的實驗A組，腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-1β、白細胞介素-10的表達相對明顯，表明實驗A組動脈血管損傷炎癥反應最重。提示在臨床工作中對動脈留置針處頻繁采集血標本的患者，為避免反復采血刺激動脈血管導致局部血管炎癥反應，應適當減少采血頻率，縮短動脈留置針留置時間，具體的留置時間還有待進一步研究。本實驗研究未對腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-1β、白細胞介素-10的表達隨時間的變化進行監測，有待進一步研究。

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Changes of Inflammatory Cytokines in Indwelling Needle-induced Local Arterial Injury

WANG An-shu1a,LUO Pei-fang1a,QIN Cheng-cheng2,ZHANG Li1b,LI Xi-xi2,YANG Ping1c,WANG Cheng2
(1a.Dept.of Cardiovascular Thoracic Surgery;1b.Dept.of Nursing Adminstration;1c.Dept.of Pediatric Internal Medicine,Affiliated Hospital of Zunyi Medical College,Zunyi 563000,China;2.School of Nursing,Zunyi Medical College,Zunyi 563000,China)

ObjectiveTo observe the change of inflammatory cytokines in local arterial injury induced by different frequencies of blood sampling and to provide reference for the standardized usage of arterial indwelling needle and the protection of artery.MethodsForty-eight New Zealand white rabbits were randomly divided into control group,experiment group A,experiment group B and experiment group C,with 12 in each group.Different times of blood sampling were performed in experiment groups while in control group,arterial indwelling needles were locked by 2 mL heparin solution with a concentration of 125 U/mL,with 2 times per day. Artery and local tissue 2 cm in radius for puncture point after 96 h were taken for immunohistochemistry to determine the expression of tumor necrosis factor α, interleukin1β and interleukin10.ResultsThe expression of tumor necrosis factor α,interleukin1β and interleukin10 reduced in experiment group A,experiment group B and experiment group C and control group in sequence.The difference of integrated optical density of the expression of tumor necrosis factor α;interleukin1β and interleukin10 in each group indicated statistical significance (all P<0.05).ConclusionThe significant expression of tumor necrosis factor α,interleukin1β and interleukin10 in arterial indwelling indicates serious inflammatory reaction in local arterial injury when arterial indwelling needle remains 96 hours.

indwelling needle;artery;inflammatory cytokines

R-332

A

10.16460/j.issn1008-9969.2015.03.001

2014-09-29

貴州省科學技術基金項目（2013-2330）

王安素（1982-），女，貴州遵義人，碩士研究生，主管護師。

張 莉（1964-），女，貴州遵義人，本科學歷，教授，護理部副主任。

方玉桂 謝文鴻]