德化黑雞線粒體DNA控制區全序列測定及起源研究

賈曉旭　陸俊賢　唐修君　顧榮　葛慶聯　高玉時

摘要：根據紅色原雞基因組DNA序列設計引物，獲得了德化黑雞線粒體DNA D-loop區全序列，結合GenBank已經測出Dloop區全序列的紅色原雞序列，探討了德化黑雞的母系起源。結果表明，德化黑雞線粒體DNA D-loop區全長1 231 bp，T、C、A、G 平均含量分別為33.5%、26.5%、26.7%、13.3%。系統發育分析發現，德化黑雞與紅色原雞滇南亞種（Gallus gallus spadiceus）聚為一類，推測德化黑雞可能起源于云南省或者附近的紅色原雞滇南亞種。

關鍵詞：德化黑雞；線粒體DNA；D-loop區；系統發育關系

中圖分類號： S831.2 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）10-0031-02

我國烏骨雞遺傳資源豐富。德化黑雞因原產自福建省德化縣而得名，是我國珍稀的烏骨雞地方品種之一，具有適應性強、肉質細嫩、清香甘潤、味道鮮美、營養豐富等優點，以其黑皮、黑肉、黑骨、黑內臟等烏色性狀深受當地群眾喜愛[1-2]。線粒體Dloop 區序列是親緣關系較近的群體進行遺傳分化研究的理想分子標記，已被廣泛用于家禽起源與進化、群體遺傳結構、品種間的系統發育關系等研究中[3]。線粒體 DNA（mitochondrial DNA，mtDNA） 是動物核外的遺傳物質，具有母系單倍體遺傳特性、在世代傳遞過程中不發生 DNA 重組、較核 DNA 突變率高及進化速率快等優點，根據其序列構建的系統發育樹能很好地反映物種的母系遷徙歷史。利用 mtDNA 序列差異研究物種的起源和進化，有助于了解物種的馴化經歷[4-6]。mtDNA 控制區 （D-loop 區） 的進化速率較其他區域高 5 ～10 倍。德化黑雞飼養歷史悠久，了解其自然群體的遺傳結構及其遺傳多樣性狀況有助于有效保種并選育利用德化黑雞。筆者測定了德化黑雞線粒體DNA D-loop區的全序列，并結合GenBank已經測出線粒體D-loop區全序列的紅色原雞的序列，從分子水平上探討了德化黑雞的起源，旨在為開發利用德化黑雞資源提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

5羽德化黑雞均采集于德化縣，翅靜脈采血，ACD抗凝，采用常規的酚/氯仿法提取血液基因組DNA，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。選取紅色原雞5個亞種Gallus gallus bankiva（NC007237）、 Gallus gallus gallus（AB007725、NC007236）、Gallus gallus murghi（HE793430、GU261707～ GU261709）、Gallus gallus jabouillei（GU261674、GU261696）、Gallus gallus spadiceus （NC007235、GU261690、GU261692、GU261693、GU261695、GU261702～GU261704、GU261706、GU261716）等已經測出線粒體DNA D-loop區全序列的19條序列，從GenBank數據庫中下載其線粒體DNA D-loop區全序列，與德化黑雞進行系統發育分析。

1.2 方法

1.2.1 引物合成 根據紅色原雞線粒體基因組的已知DNA序列（GenBank序列號：NC_007235）作為參考序列，在D-loop區上游、下游用Primer Premier 5.0軟件設計1對引物，引物序列分別為：PF：5′-AAACACCCAAACTCACTAAC-3′；PR：5′-CACTGGGATGCGGATACTTGC-3′。預計擴增長度1 600 bp，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.2 PCR擴增和測序 PCR擴增體系（50 μL）：25 μL PCRMix（南京博爾迪公司），10 μmol/L引物各1.5 μL，模板 2 μL，滅菌水20 μL。反應程序為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，53 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，30個循環；72 ℃ 4 min。1.5%低熔點瓊脂糖（Promega公司）凝膠電泳檢測PCR產物，用試劑盒回收純化，交由上海英駿生物技術有限公司進行測序。所有序列采用雙向測序，以便比對核實。

1.2.3 數據處理和分析 將得到的序列與 GenBank 中紅色原雞參考序列進行比對，剪掉引物及多余的序列，DNA 序列片段經 DNAStar 5.02 軟件的SeqMan程序拼接。用 MEGA 4.0 進行轉換與顛換數目的統計和堿基組成分析，采用鄰接法（Neighbor-Jointing，NJ） 構建系統發育樹，發育樹選用 Kimura 2 模型，1 000 次重復[7]。

2 結果與分析

2.1 德化黑雞mtDNA D-loop區 PCR擴增

對德化黑雞DNA模板進行PCR擴增，經瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果表明1 600 bp左右有1條特異性條帶，與預期結果一致（圖1）。

2.2 德化黑雞線粒體DNA D-loop區序列分析

設計的引物在德化黑雞基因組中得到了較好的擴增，將測序結果剪掉引物及多余的序列，發現5羽德化黑雞個體序列相同，沒有發現堿基突變，長度為1 231 bp，T、C、A、G 4種堿基含量分別為33.5%、26.5%、26.7%、13.3%，其中A+T

含量（60.3%）明顯高于G+C含量（39.7%），線粒體DNA D-loop區為非編碼區，富集A/T堿基，能被RNA聚合酶等特異分子識別，從而作為轉錄的起始序列。與參考序列相NC007235比較（圖2），德化黑雞共發現8處多態位點，變異區在167～215 bp之間，全部為轉換，其中T-C轉換5處，A-G轉換3處。

2.3 德化黑雞與原雞系統發育分析

根據德化黑雞線粒體DNA D-loop區全序列，采用NJ法構建了德化黑雞與原雞的系統發育樹（圖3）。德化黑雞先與原雞滇南亞種GGS7聚為一類，節點的自舉置信度（BP）值為95%；然后與原雞滇南亞種GGS1、 GGS4聚為一類，節點的自舉置信度（BP）值為76%；最后與原雞海南亞種（GGJ1、GGJ2）聚為一類，節點的自舉置信度（BP）值為51%。根據GenBank上的信息，GGS7（GU261695）樣本采自云南省，GGS4（GU261704）樣本采集于緬甸。

3 結論與討論

國內外有關雞mtDNA D-loop區的研究大都集中在高變區[8-10]，區域較小，得到的信息可能不全面。德化黑雞D-loop區全序列同參考序列相比，686、1 215 bp處存在堿基轉換。因此筆者認為，用mtDNA D-loop區全序列進行遺傳多樣性、起源進化分析更為準確。本研究發現，5羽德化黑雞個體序列相同，沒有發現堿基突變，可能與樣本量少有關，也可能因為德化黑雞是較封閉的原始雞種，未受其他外來雞種的侵入，因而變異程度較低。線粒體DNA在遺傳過程中，遺傳物質通過卵細胞質傳遞，較少發生DNA 重組，其野生祖先的線粒體DNA 類型一般能得以保持。這種遺傳方式，1個個體就能代表1個母性集團，因此只需少量個體樣本便能反映1個群體的遺傳結構。研究者可以從復雜的遺傳背景中分辨不連續的母系血統，即使經過幾千年的雜交繁育，系統關系依然明晰[11]。德化黑雞先與原雞滇南亞種GGS7（GU261695）聚為一類，然后與GS1 （NC_007235）、GGS4（GU261704聚為為一類，說明原雞滇南亞種（Gallus gallus spadiceus）在德化黑雞形成過程貢獻最大，最后與原雞海南亞種（GGJ1、GGJ2）聚為一類，說明原雞海南亞種與德化黑雞親緣關系也較近。參照Liu等對線粒體DNA D-loop區單倍型劃分標準，德化黑雞應屬于A分支[8]。章學東等研究發現，東鄉綠殼蛋雞也是以A分支為主，說明兩者關系較近，從形態學上，兩者個體多為黑羽、烏膚、烏冠，并且都有紅冠個體，也驗證了兩者親緣關系較近，在地理位置上，福建省和江西省毗鄰，推測可能兩者存在基因交流[12]。

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