山葡萄黃烷酮3—羥化酶VamF3H基因及其克隆

李娟　曹芳芳　權哲　劉海峰

摘要：采用RT-PCR與RACE技術相結合的方法，從山葡萄果皮中克隆到黃烷酮3-羥化酶（F3H）基因的cDNA全長序列。該基因全長1 398 bp，包含1 092 bp的完整開放閱讀框，編碼363個氨基酸，相對分子質量為40.81 ku，等電點（PI）值為5.37。二級結構預測表明，隨機卷曲是VamF3H蛋白最大量的結構元件，不具有信號肽，屬于不穩定親水蛋白。氨基酸序列與歐亞種葡萄（FQ389950）、圓葉葡萄（KF040970）、美國蔓藤（JX087441）等的F3H類基因同源性較高，相似性分別為99%、99%、96%。

關鍵詞：山葡萄；cDNA克??；黃烷酮3-羥化酶

中圖分類號： S663.101 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）10-0036-05

黃烷酮3-羥化酶（flavanone 3-hydroxylase，F3H）是花色素合成途徑中的結構基因，是花青素生物合成途徑中的關鍵酶[1]。F3H屬于依賴2-酮戊二酸的雙加氧酶，反應需要2-酮戊二酸、分子氧、鐵、抗壞血酸[2]。其作用為催化柚皮素C3位羥基化，生成二氫山奈酚（dihydrokaempferol，DHK），而DHK是黃酮和異黃酮合成的重要中間產物；因此，F3H調控著黃酮與花青素苷產物的合成，是整個黃酮類化合物代謝途徑的中樞位點[3]。有報道指出F3H與花青苷合成關系密切[4]，然而此方面的研究尚較少。Holton等發現F3H對黃烷酮、兒茶酸、原花青素、花青素代謝影響較大，是該代謝途徑的關鍵酶[3]。Lepiniec等研究證實，由F3H和F3′H催化生成的黃烷酮醇在DFR的催化作用下能夠合成無色花青素[5]。F3H的活性最初在紫羅蘭花中被檢測到[6]。Martin等利用鑒別篩選與基因圖譜技術首次從金魚草中分離克隆到F3H基因[7]。研究表明，F3H基因在矮牽牛等植物中是獨立表達的，而大多數情況下，F3H與其上游的CHS、CHI基因，以及下游的DFR基因協同表達[8]。在大多數物種中，F3H基因僅以單拷貝形式存在[9-11]。

山葡萄別稱野葡萄，最初發現于我國東北和俄羅斯遠東地區，在我國主要分布于吉林省長白山、黑龍江省完達山、小興安嶺、遼寧省北部等地[12]。山葡萄是我國重要的野生果樹資源，具有極強的抗寒性，是東北地區釀造葡萄酒的主要原料[13]，其漿果含有大量花色苷。目前，分子生物技術已廣泛應用于葡萄遺傳育種的各個領域，加速了葡萄遺傳學圖譜、基因的克隆表達、新基因的分離鑒定等研究的進展[14]。F3H基因已在玉米、矮牽?；?、水母雪蓮等很多植物中克隆得到并且定性[15]。在擬南芥、茄子、苜蓿、葡萄、蘋果、柑橘、梨、康乃馨、翠菊、日本牽牛等植物中均克隆到了F3H基因，但未見山葡萄中F3H基因的相關報道。本研究采用RT-PCR和RACE技術相結合的方法克隆F3H基因，獲得全長序列，并進行生物信息學分析，旨在為闡明山葡萄花色苷的生物合成及調控奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 供試山葡萄品種為雙豐（Vitis amurensis Shuang Feng），采自國家山葡萄種質資源圃。采摘無病蟲害、飽滿的成熟期果粒，立即置于液氮中冷凍，并于-80 ℃冰箱保存，取其果皮作為供試材料。

1.1.2 菌株、酶、生化試劑 Tris-HCl、CTAB、EDTA、無水LiCl、β-巰基乙醇、DEPC水、AMP、IPTG、X-gal均為AITiresco分裝試劑；大腸桿菌DH5α、pMD19-T載體、Taq酶、Marker DL 2 000均購自TaKaRa公司；膠回收試劑盒購自OMEGA公司；反轉錄酶SuPerscriptll購自invitrogen公司；SMARTTM RACE試劑盒購自Clonteeh公司；其他試劑均為國產分析純。引物由英俊生物技術有限公司合成，DNA測序由上海生工生物公司完成。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 登錄NCBI網站，根據GenBank中已登陸的F3H基因的核苷酸序列和氨基酸序列，通過多序列比對確定其共有的保守區，利用Primer 6.0軟件設計1對特異引物用來擴增目的片段。上游引物F1：5′-TGTCTGGTGGCAAGAAAGGC-3′；下游引物F2：5′-CGAGGGTGAGGTCTGGCTGT-3′。

以該引物擴增出的序列設計5′RACE和3′RACE引物，分別為：F3H-a：5′-AGCGTCCTTGTCCAAATCCA-3′；F3H-s：5′-CGTTTCCAGCCATCTTCA-3′。

1.2.2 山葡萄果皮總RNA的提取及cDNA的合成 采用改良的CTAB[16]法提取山葡萄果皮中的總RNA。采用紫外分光光度計測定其230、260、280 nm處的吸光度及總RNA濃度，用1%TAE檢測RNA的完整性。

按照Invitrogen公司的SuperScriptⅡ反轉錄酶試劑盒說明書，以Oligo（dT）20為引物、總RNA為模板進行逆轉錄反應，合成cDNA的第1條鏈。

1.2.3 PCR擴增目的基因片段 以山葡萄cDNA第1鏈為模板，用引物F1、F2進行PCR擴增。50 μL反應體系包括：2.0 μL cDNA、5.0 μL 10×Ex Taq Buffer（Me2+ free）、0.4 μL Ex Taq（5 U/μL）、36.6 μL ddH2O、F1和F2引物各1.0 μL。反應程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環；最后72 ℃延伸7 min，于4 ℃保存。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并回收純化目的片段。

1.2.4 5′RACE和3′RACE法獲得基因片段 參照SMARTTM RACE試劑盒說明書，以逆轉錄分別合成的5′-RACE-Ready-cDNA和3′-RACE-Ready-cDNA為模板，以F3H-a、F3H-s分別同UPM為引物，進行5′RACE、3′RACE擴增以獲得5′端片段、3′端片段。PCR反應程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，共35個循環；最后72 ℃延伸7 min，于4 ℃保存。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測以確定條帶。

1.2.5 目的片段的回收和連接 按照膠回收試劑盒說明書對PCR產物的DNA片段進行回收、連接、轉化。將回收的DNA片段與pMD-18載體連接，于16 ℃連接3 h。反應體系為pMD-18載體0.5 μL、DNA片段4.5 μL、SolutionⅠ5.0 μL。

1.2.6 轉化 將DH5α感受態細胞解凍后，取50 μL加入10 μL連接產物，冰浴30 min；取出后熱激90 s，并置于冰上2～3 min；加入預熱的LB液體培養基300 μL，于37 ℃、190 r/min培養1 h；取適量菌液涂布于含有AMP、X-Gal、IPTG的LB固體培養基平板上，于37 ℃培養箱中倒置培養過夜。次日，挑白色單克隆置于37 ℃搖床中，200 r/min培養12 h。隨后進行菌液PCR檢測，將成功克隆的菌樣測序。

1.3 VamF3H基因序列及其編碼蛋白質的生物信息學分析

利用DNAstar軟件查找VamF3H基因的開放閱讀框（ORF）并推導其氨基酸序列；利用NCBI的BLAST程序檢索數據庫，對VamF3H基因全長cDNA序列及其氨基酸序列進行比對分析；利用ProtParam在線軟件（http：//www.expasy.org/tools/protparam.html）分析VamF3H基因編碼蛋白質的理化性質；運用ProtScale在線軟件（http：//ca.expasy.org/tools/protscale.html）、TMHMM在線軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0）、SignalP在線軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）對所編碼蛋白質的親水性、疏水性、跨膜結構域、信號肽進行分析；通過ExPASY中的HNN工具分析其蛋白質序列的二級結構；采用GeneDoc軟件進行多序列比對，并采用MEGA 6.0軟件構建系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 山葡萄VamF3H基因cDNA全長的克隆及序列分析

以山葡萄果皮總RNA反轉錄的cDNA為模板，用特異引物F1和F2擴增出1條324 bp的預期片段（圖1-a）。經Blastn分析發現，該序列與其他物種F3H基因高度同源，與歐亞種葡萄（FQ389950）的同源性高達99%，初步確認其為山葡萄F3H基因的核心序列。根據所得中間段序列設計末端擴增的特異引物F3H-a和F3H-s，經RACE擴增、產物克隆、測序后，分別得到長度為965 bp的3′末端和647 bp的5′末端（圖1-b）。將RT-PCR和RACE擴增片段進行序列拼接得到VamF3H基因cDNA全長序列，最終獲得1條長為1 398 bp的cDNA全長序列，經Blastn比對發現，該cDNA序列與其他物種的F3H基因同源。

經DNAstar軟件分析發現，該cDNA包含1個1 092 bp的完整開放閱讀框、214 bp的3′-非翻譯區、92 bp的5′-非翻譯區，推測其編碼363個氨基酸。GenBank登錄號為KP966099，將其命名為VamF3H。

2.2 VamF3H基因編碼蛋白質的理化性狀

利用ProParam軟件在線預測分析VamF3H基因編碼蛋

白的理化性質，發現該蛋白由363個氨基酸組成，相對分子質量（MV）為40.81 ku，等電點值為5.37。組成VamF3H蛋白的20種氨基酸中亮氨酸（Leu）含量最高，達到9.9%；半胱氨酸（Cys）、色氨酸（Trp）含量最少，僅為1.4%。正電荷殘基（Arg+Lys）數為45個，負電荷殘基（Asp+Glu）數為55個，不穩定指數為44.25，脂肪指數為84.33，表明VamF3H基因蛋白屬于不穩定蛋白質。

2.3 VamF3H蛋白保守區預測

利用NCBI的BlastP程序，在蛋白保守區數據庫預測山葡萄VamF3H基因的蛋白保守區。結果表明，VamF3H具有2-酮戊二酸的雙加氧酶（2-ODD）結構域、非血紅素雙加氧酶結構域。VamF3H具有特征性結構域FE2OG_OXY PS51471（圖2），屬于雙加氧酶家族。

2.4 VamF3H蛋白的親水性

利用ProtScale程序分析山葡萄VamF3H基因氨基酸序列的親水性及疏水性（圖3）。圖中縱坐標為氨基酸標度值，橫坐標為氨基酸序列位置。依據氨基酸分值越低親水性越強、分值越高疏水性越強的規律，可明顯看出疏水性最大值在第168位點，值為1.900；最小值在第145位點，值為-2.722?？偲骄H水性指數為-0.444，整體表現為親水性。

2.5 VamF3H蛋白的跨膜結構域

根據TMHMM、TMpred Server網站分析，超過500分才被認為顯著?？梢奦amF3H蛋白無跨膜螺旋，故可推測VamF3H不含有跨膜結構域。

2.6 VamF3H蛋白的信號肽預測及二級結構

利用SignalP 4.1 Server軟件對山葡萄VamF3H基因蛋白進行信號肽預測。結果表明，VamF3H基因編碼的蛋白不具有信號肽。

利用HNN軟件在線預測VamF3H基因的二級結構（圖4）。該蛋白的二級結構由48.48%的無規卷曲（random coil）、32.78%的α-螺旋（alpha helix）、18.73%的β-折疊（extended strand）組成。

2.7 山葡萄VamF3H編碼蛋白質的同源性及進化

登陸NCBI主頁，利用BlastP在線軟件將克隆得到的VamF3H基因編碼氨基酸序列進行同源性搜索比較。結果表明，該基因與歐亞種葡萄（FQ389950）、圓葉葡萄（KF040970）、美洲種葡萄（JX087441）、桑樹（KF438044）等的F3H類基因同源性較高，相似性分別為99%、99%、96%、81%。利用GeneDoc軟件對包括VamF3H在內10個物種的F3H基因編碼的氨基酸序列進行多重比對分析（圖5），圖中劃線部分為保守結構域。

為進一步分析VamF3H與其他植物F3H之間的進化關系，在多重比對的基礎上，利用Mega 6.0軟件對該基因及其他植物F3H基因的氨基酸序列進行系統進化分析（圖6）。結果表明，山葡萄VamF3H基因與歐亞種葡萄、圓葉葡萄、美國蔓藤的同源性最高，與梨、風毛菊等親緣關系較遠。

3 結論與討論

本研究利用同源克隆和RACE技術相結合的方法，從山葡萄果皮中克隆獲得F3H的同源基因VamF3H，并對其編碼的蛋白質進行生物信息學分析。二級結構預測發現，該蛋白的二級結構以無規卷曲為主，其次為α-螺旋，再次為β-折疊，無其他二級結構元件，此預測結果與已報道的草莓、葡萄、海棠F3H蛋白的二級結構一致[17]。保守結構域分析表明，該基因編碼的蛋白具有典型2-O-酮戊二酸和Fe2+-依賴的雙加氧酶家族（2OG-FeⅡ_Oxy）的保守結構域，該結構域中含有與鐵離子結合所需的組氨酸、天冬氨酸，以及與2-O-酮戊二酸結合所需的精氨酸、絲氨酸保守位點，這些都是植物雙加氧酶超家族基因的典型特征。系統進化分析顯示，VamF3H與同屬的歐亞種葡萄F3H親緣關系最近，而與薔薇科的梨、菊科的風毛菊親緣關系較遠，可見VamF3H的進化具有明顯的種屬特性。

從以上核苷酸、氨基酸較高的相似系數可知，F3H基因在進化上較為保守，因為F3H僅以單拷貝形式存在于大多數物種中，提示F3H基因可能在花青素生成中具有重要地位。單拷貝基因比多拷貝基因更易于調控，且F3H基因在進化上保守性很高，少數幾個堿基的突變就可能造成基因失活，從而阻礙花青素的生成。目前，關于控制花青素生成的研究主要集中于控制花青素生成的結構酶，并通過轉入結構酶的基因以獲得結構酶的過量表達，從而增加花青素的生成，而關于調控結構酶的基因或調控因子的研究尚未見報道；因此，研究花色素調控基因比單純研究結構酶更具有意義。

通過獲得的F3H基因cDNA全長序列，可在以下方面做進一步研究。驗證F3H基因在山葡萄中是否為單拷貝存在。F3H基因在很多物種中均以單拷貝存在，而葡萄中的F3H則為2個拷貝[18-20]，因此推測VamF3H也同為2個拷貝?？墒褂肧outhem Blot技術驗證F3H基因在山葡萄的果皮、果肉、根、莖、葉、種子等部位中是否為2個拷貝。將已有的F3H基因作為探針，與山葡萄基因組文庫雜交，可獲得F3H基因組DNA序列，以進行內含子組成、外顯子組成、結構預測等分子生物學分析，為山葡萄花色素的研究提供分子生物學基礎。

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