小白鼠6種組織部位總DNA不同提取方法的比較

張雨欣　高秋　逄洪波　趙佳欣　秦源源　姚麗梅　魏繼瑩

摘要：為了得到經濟、簡便、易于操作且效果好的基因組DNA，選取小白鼠6種不同的組織部位：肝、脾、腎、尾、肺和心臟，分別采用SDS法和CTAB法提取基因組DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳、紫外分光光度計和PCR3種手段對其質量和濃度進行檢測，結果顯示：小白鼠6種組織部位采用SDS和CTAB法提取的基因組DNA均可擴增得到目的基因，滿足下一步分子生物學試驗的要求。但是從DNA的質量和產量方面，不同組織部位之間具有很大差別，CTAB法和SDS法針對不同的組織部位具有不同的優勢?？傮w來看，在小鼠的6種組織部位中，肝臟最適合用來提取基因組DNA。

關鍵詞：SDS法；CTAB法；基因組DNA；DNA提??；小白鼠；組織器官

中圖分類號： Q523 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）10-0047-03

DNA是生物體的基本遺傳物質?；蚪MDNA的提取是分子生物學的基礎試驗操作[1]，其提取效率和質量的好壞直接決定了后面一系列基因工程試驗的成敗，如基因分離、AFLP、RAPD、SSR等。因此，學習、掌握DNA提取方法并對其進行比較、總結，有利于后續試驗的順利開展。國內外研究人員已經發現并使用了許多種DNA提取方法[2-7]，并且針對不同生物體的具體特點，對許多方法進行了改良，摸索出適用于具體物種的高效方法[8-15]。目前，傳統的SDS法和CTAB法由于其成本低廉、提取的DNA質量相對較好，在實際應用中仍占有主要地位。隨著生物技術的普及和應用，使用試劑盒提取基因組DNA逐漸增多[16-19]?；蚪M提取試劑盒具有操作簡便、節省時間等獨特優勢，但是對于一般的實驗室、特別是普通高等學校來說，由于價格較為昂貴，在很大程度上限制了其使用范圍；尤其對剛接觸分子生物學試驗的初學者，只知道按照說明書流程操作，不了解試劑的化學成分、具體配制方法及作用，不利于理解、掌握試驗的基本原理，動手能力差、試驗技能得不到提高，最終出現一旦離開試劑盒，什么試驗也不會做的情況。本試驗以普通試驗動物小白鼠作為提取基因組DNA的材料，選取小白鼠的6個組織部位，分別是肝、脾、腎、尾、肺和心臟，采用提取基因組DNA的經典方法SDS法和CTAB法，提取小白鼠的基因組DNA，并對其質量、濃度、純度進行檢測，從中篩選出經濟、簡便、易于操作、質量良好的基因組DNA，這對于今后的試驗教學和科研工作具有重要的指導作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 小白鼠購自沈陽醫學院實驗中心。

1.1.2 試劑 dNTP、DNA Marker、高保真酶均購自寶生物工程（大連）有限公司，引物于Invitrogen 北京分公司合成，CTAB和SDS法提取液配制所需藥品購自Sigma，其余所用的化學試劑（氯仿、異戊醇、異丙醇、乙醇等）均為國產分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 SDS提取法 參照中真核基因組DNA提取方法[方案5][1]從鼠尾或其他小樣本中制備基因組DNA并作適當修改。此流程最初由Palmiter等[20]提出，現在關于動物基因組提取的很多方法都是由此衍生而來的。其具體步驟如下：

樣品預處理：解剖小鼠，PBS磷酸緩沖液沖洗各組織部位后，將組織盡量剪碎后分別放入凍存管，液氮速凍后，保存于-70 ℃。其中尾巴部位剪成1 cm左右小段。取小鼠不同部位組織至滅菌研缽中，液氮研磨。研磨好的樣品放入到滅菌離心管中，為了便于試驗結果的比較，將研碎的組織均加入到離心管500 μL刻度處。加入500 μL SNET裂解緩沖液，再加入10 μL蛋白酶K（20 mg/mL）使終濃度達到400 μg/mL，充分混勻后，60 ℃保溫1.5 h。待冷卻至室溫時加入等體積氯仿 ∶ 異戊醇（24 ∶ 1），上下溫柔翻轉5 min；12 000 r/min，室溫離心10 min，取上清液轉移到新的1.5 mL離心管中。加入2.5 μL RNaseA（10 μg/μL），37 ℃保溫30 min除去其中的RNA。加入等體積氯仿 ∶ 異戊醇（24 ∶ 1），上下溫柔翻轉5 min；12 000 r/min，離心10 min，取上清液到1個新的1.5 mL離心管中，重復此操作1次。加入2/3倍體積異丙醇，-20 ℃靜置10 min，沉淀DNA。4 ℃，12 000 r/min離心 10 min 收集沉淀的DNA。用70%的乙醇清洗沉淀，4 ℃12 000 r/min 離心5 min，去上清。用冷凍的無水乙醇清洗沉淀。4 ℃ 12 000 r/min離心7 min，去上清。室溫干燥DNA。加入20 μL TE溶解DNA，-20 ℃保存備用。

1.2.2 CTAB提取法 參照Doyle等的方法[3]，并進行適當修改。試驗流程絕大部分與SDS法相同，只在劃線處存在變動。劃線處試驗步驟改為：將研磨好的樣品，加入預熱好的4×CTAB提取液500 μL，同時加入10 μL的β-巰基乙醇。

1.2.3 基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳 2種方法提取不同組織部位的基因組DNA，每個樣品吸取1 μL原液，選擇λ-HindⅢ 作為DNA marker，0.8%瓊脂糖凝膠電泳，120 V，30 min，EB染色后，凝膠成像儀（中國北京賓達英創科技有限公司，202D型）拍照保存。

1.2.4 基因組DNA質量和濃度測定 使用超微量分光光度計NanoDrop 2000（Thermo）檢測DNA 的純度及濃度，分別測定基因組DNA 在D260 nm 和D280 nm 的吸光度，以及D260 nm/D280 nm 和D260 nm/D230 nm比值。同時，測定提取的基因組DNA 的濃度。

1.2.5 PCR擴增 使用小鼠看家基因引物[21]Actin F（5′-CGGGACCTGACCGACTACCT-3′）和Actin R （5′-GGCCGTGATCTCCTTCTGC-3′） 進行擴增，目的片段長411 bp。試驗采用20 μL體系，成分如下：13.7 μL ddH2O；2.0 μL 10×PCR Ex buffer；2.0 μL dNTP （2.5 mmol/L each）；0.8 μL Actin F（5 mmol/L）；0.8 μL Actin R （5 mmol/L）；0.5 μL DNA模板。提取的12個基因組DNA樣品，根據濃度將其稀釋成不同倍數，達到終濃度大約為8 ng/μL，用作PCR模板。PCR程序設為：94 ℃預變性3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30個循環；最后72 ℃延伸5 min。吸取5 μL擴增產物，0.8% 瓊脂糖電泳檢測目的基因擴增情況。

2 結果

2.1 瓊脂糖凝膠電泳檢測結果

SDS法和CTAB法提取6個組織部位基因組DNA，每個部位每種方法任選1個作為代表，吸取1 μL原液，同時吸取3 μL DNA marker進行瓊脂糖凝膠電泳后，結果如圖1所示，12個點樣孔跑出的電泳條帶，除了腎/SDS、心/SDS和心/CTAB條帶較暗外，其余9個樣品條帶較亮、無拖尾；與λ-HindⅢ相比較，所有樣品DNA大小均在10 kb左右（如圖2左側箭頭所示），說明提取的基因組DNA完整性較好。但是幾個濃度大的樣品，點樣孔存在不同程度EB吸收，并且在基因組DNA條帶后方、靠近點樣孔一側有明亮度不同的條帶，濃度低的樣品則沒有，而將濃度高的DNA樣品進行稀釋后，重新進行瓊脂糖凝膠電泳，這一現象消失。因此推測此種現象很可能是由于DNA濃度過大造成的。脾/CTAB法提取的基因組DNA中的RNA條帶較為明顯。

2.2 紫外分光光度計檢測DNA質量和濃度

采用紫外分光光度法測定提取的基因組DNA的純度和濃度，D260 nm/D280 nm比值用來衡量蛋白質的去除情況，D260 nm/D230 nm比值用來衡量鹽分去除情況，結果如表1所示。2種方法提取6種不同組織部位的基因組DNA，濃度和質量方面有很大差異。

在DNA濃度方面，SDS法提取6個組織部位的基因組DNA中，肝臟濃度最高，達到了（7 053.60±48.00）ng/μL；心臟最低，平均值只有13.32 ng/μL，兩者濃度相差了500多倍；其余幾個部位的濃度，從高到低依次為肺>脾>尾>腎。采用CTAB法提取的6個組織部位的基因組DNA，DNA濃度的數值也是肝臟最大（2 871.10±67.18）ng/μL，心臟最低（8.27±0.35）ng/μL，這點與SDS法相同，但是所獲得的基因組DNA濃度均低于SDS法。其余4個部位的DNA濃度，從高到低依次為脾>腎>尾>肺。

在提取的DNA質量方面，主要根據D260 nm/D280 nm和D260 nm/D230 nm的比值來衡量。D260 nm/D280 nm的比值可以看出基因組DNA中蛋白質和RNA的去除情況。純凈DNA的D260 nm/D280 nm比值應為1.8，如果小于1.6說明有蛋白質、酚等污染，如果大于1.9，證明RNA去除不完全。

從表1可以看出，腎/SDS純度最差，平均值只有1.47；其次是心/SDS和心/CTAB，分別是1.71和1.68；脾/CTAB比值是2.05；而其余幾個樣品提取的基因組DNA質量較好，范圍在1.73～1.86之間。D260 nm/D230 nm的比值可以檢測出基因組DNA中鹽分的去除情況，如果DNA鹽分去除完全，D260 nm/D230 nm的比值應該在2.0以上。提取的所有樣本，除了肺/SDS、尾/SDS、脾/SDS、脾/CTAB和肝/CTAB這5個樣品的值接近于2.0（在1.93～2.06之間）之外，剩下的7個樣品的鹽分都沒有去除完全（0.78～1.73），特別是其中的腎/SDS，比值只有0.78。

2.3 PCR檢測

將2種方法6種不同組織部位提取的基因組DNA樣品進行PCR擴增，吸取5 μL PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，結果見圖2。由圖2可見，以0.5 μL DNA作為模板進行PCR擴增，1～12號點樣孔均出現明亮、特異的條帶，條帶大小400多bp，符合目的片段的長度。同時陰性對照無任何條帶出現，證明在整個PCR擴增過程中沒有污染。

3 討論

小白鼠是高校常用的一種試驗動物，其組織部位由于其細胞類型、代謝產物等成分的不同，對不同的提取方法適用性也不一樣。并且由于含有的一些特殊物質，導致在基因組DNA提取過程中，操作的難易度也不一樣。試驗共選取了6個組織部位，肝、脾、腎、尾、肺和心臟，盡管對樣品進行了預處理（盡量將組織減碎），但是在研磨的難易度上，不同組織部位，差別很大。最容易研磨的部位是肝臟，并且肝臟的樣品量最大，得率也最高；最不容易研磨的部位是尾巴，但是尾部除去漂浮的毛后，含的雜質最少，上清液最為清晰，后面的試驗操作最為容易。而脾、肺、心的上清液都比較黏稠，后面較難操作。

為了節省時間，提高試驗效率，將細胞裂解、釋放基因組DNA的時間進行了改良，即水浴時間縮短到1.5 h。同時為了便于比較2種方法的優劣，水浴的溫度都定在了60 ℃，觀察紫外分光光度計的檢測結果，可以看出，除了腎/S、心/S和心/CTAB外，大部分樣品的蛋白都去除得比較徹底。

SDS法提取6個組織部位得到的基因組DNA，D260 nm/D230 nm的比值普遍都低于2.0，說明SDS法提取基因組DNA時，去鹽不完全，但是從PCR結果來看，可以擴增出目的基因，說明用于普通的分子生物學操作沒有問題。如果用于要求較高的分子生物學試驗，可以采取無水乙醇洗滌沉淀DNA、DNA溶于水而不是TE等措施除去多余鹽分，從而進一步純化提取的基因組DNA。而腎/SDS相對腎/CTAB的濃度來說，得率非常低，有可能是SDS法不適合用于提取腎臟部位DNA，腎/SDS的D260 nm/D280 nm和D260 nm/D230 nm的比值（均是最差的數值）也從另一方面說明了SDS方法提取腎臟部位的基因組DNA質量稍差。

CTAB法提取的6個組織部位的基因組DNA濃度，除了肝臟（最高）和心臟（最低）外，其余4個部位從高到低依次為脾>腎>尾>肺；而SDS法為肺>脾>尾>腎，說明在這4個組織部位中，2種方法各具優勢。根據D260 nm/D280 nm的測定結果，相對于脾/SDS=1.79的比值，脾/CTAB質量稍差，達到了2.05，說明RNA沒有去除完全，基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖片也說明了這一點。另外一個與SDS法差別較大的是腎臟，SDS法測的比值只有1.47，而腎/CTAB達到了1.79。說明CTAB法比較合適腎臟部位基因組DNA的提取。

總的來看，采用SDS和CTAB 2種方法對小鼠的6個組織部位基因組DNA進行提取，提取的基因組DNA基本都能滿足分子生物學研究。根據瓊脂糖凝膠電泳圖片、DNA的濃度和純度，及PCR擴增效果，說明SDS和CTAB這2種提取方法，對于不同的組織部位具有不同的優勢。綜合來看，小鼠的6個組織部位中，肝臟最合適用來作為提取基因組DNA的材料。

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