利用枯萎病菌毒素篩選草莓枯萎病抗性突變體

蘇媛　劉雪靜　尹寶重　甄文超

摘要：以豐香、童子一號、全明星、森格那、達賽萊克特5個品種草莓組培苗為試材，以草莓枯萎病菌毒素作為選擇壓力，篩選草莓抗枯萎病突變體，對突變體再生植株與野生型植株的生長、分化進行鑒定。結果表明，草莓枯萎病菌粗毒素對植株和莖尖生長點均有較強的毒害作用，經粗毒素處理的植株可產生與枯萎病相似的癥狀。在毒素含量為10%的條件下繼代培養3次后，豐香品種的存活率上升最顯著；于毒素含量為15%的培養基繼代培養3次后，森格納、全明星品種的存活率上升最顯著。在15%毒素濃度下，繼代3次培養的草莓抗性不定芽存活率均不同程度低于10%毒素濃度，其中下降幅度最小的是全明星品種，僅為7.6%。在含有毒素的培養基上培養，AS-1、TZ-1抗性不定芽分化最為穩定，分別比同品種的野生型不定芽高49.61%、50.38%；可見，在含有毒素的培養基上繼代培養可提高不定芽對毒素的抗性?？共⌒澡b定結果表明，突變體再生植株對枯萎病菌的抗性高于野生型再生植株。選用OPP-18特異性引物對TZ-1與童子一號品種進行RAPD分析，電泳結果顯示，在750～1 000 bp之間存在特異性條帶；選用 OPO-05 引物對其進行篩選，擴增出清晰可辨的3條非特異性條帶，表明所獲得的抗性植株與野生型植株在基因水平上發生了改變，可被認定為突變體。

關鍵詞：枯萎病菌毒素；草莓；枯萎??；抗性不定芽；篩選；RAPD分析

中圖分類號：S436.68+4 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）10-0158-04

草莓（Fragaria ananassa Duch.）屬于薔薇科草莓屬，在果樹生產中占有重要地位。目前，中國草莓栽培面積、產量分別約為13.5萬 hm2、200萬 t，均居世界首位。中國草莓產區廣泛采用設施栽培，并由于耕地數量的限制，使連作面積不斷上升。連作草莓生長發育不良、土傳根部病害均日趨嚴重，被稱為連作障礙[1-2]。草莓枯萎病是一種由尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum Schl. f. sp. fragariae）侵染引起的真菌病害，對草莓的生長和產量造成很大影響，而連作障礙會顯著增加草莓枯萎病的發生。調查發現，未經土壤消毒處理地塊的草莓第2年連作枯萎病發病率達90%，減產超過20%；第3年連作發病率達100%，減產超過40%[3]。目前，對草莓連作障礙的防治大多采用種植前的土壤消毒，常用化學藥劑有溴甲烷、氯化苦、棉隆、威百畝等?；瘜W藥劑效果明顯，但均存在不同程度的毒性大、污染環境、操作技術嚴格等問題。

植物病原菌毒素是植物病原菌產生的對寄主植物具有毒性的代謝產物，是導致植物病害發生的主要原因之一[4-5]。離體條件下篩選植物抗病突變體，是結合植物組織培養技術，應用病菌毒素或類似毒素的化學物質在細胞水平上選擇抗病突變體，是高等植物抗病育種的一種嘗試[6]。劉海瑞等研究了香蕉抗枯萎病突變體，以香蕉枯萎病菌產生的致病毒素為選擇壓力，在短期內離體誘發和篩選抗香蕉枯萎病的突變體，提出簡便可行的篩選和鑒定方案[7]。黃麗麗等利用紫外線誘變的方法選育出小麥條銹菌病突變體，該突變體抗病性強、抗性穩定[8]。趙明敏等以茄子黃萎病菌毒素作為選擇劑，離體篩選茄子抗黃萎病突變體，并對不同抗性的茄子幼苗、愈傷組織進行系統研究，結果表明茄子愈傷組織能夠較好地表達植株水平的抗性[9]。本研究以草莓的莖尖生長點為試材，采用病原菌毒素作為選擇壓力進行誘變處理，離體篩選草莓抗枯萎病突變體，比較突變體與野生型植株的基因型，確保植株水平與分子水平的一致性，旨在為草莓抗病突變體離體篩選程序的確定，及愈傷組織早期抗性鑒定奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試草莓品種為豐香、童子一號、全明星、森格那、達賽萊克特。供試病原菌為尖孢鐮刀菌草莓?；?，由河北農業大學植病生態學研究室分離得到。

1.2 試驗方法

1.2.1 枯萎病菌毒素的制備和毒性測定 將尖孢鐮刀菌在PDA平板擴繁，從菌落邊緣切取直徑為5 mm的菌絲片，轉接至裝有150 mL Czpeks培養液的三角瓶中，每瓶5片，于 25 ℃、110 r/min條件下，12 h交替振蕩培養14 d；培養完成后經4層紗布過濾，以5 000 r/min離心20 min，取上清液并用0.45 μm 孔徑的微孔濾膜加壓過濾，得到的無菌濾液即為毒素原液[10]。將毒素以10倍濃度梯度稀釋后澆灌長勢基本相同的草莓植株，每株澆灌15 mL，于25 ℃、光周期14 h光/10 h 暗條件下培養20 d，觀察其根部癥狀。

1.2.2 草莓抗枯萎病不定芽的篩選 將草莓莖尖（0.1～0.3 mm）分別接種于含毒素原液5%、10%、15%、20%的培養基上，培養20 d后統計外植體存活率，確定毒素的半致死劑量，以不含毒素的培養基為對照。每個處理4次重復，每個重復20個莖尖。采用多步選擇法逐級加壓篩選：將草莓外植體在含有半致死劑量毒素的培養基上繼代培養3次后，挑選生長較好的愈傷組織，將其轉入毒素濃度高1個梯度的培養基上繼代培養3次，每個繼代周期為30 d，培養完成后調查外植體生長狀況。將篩選出的抗性不定芽和野生型不定芽于照度3 000 lx、光周期14 h光/10 h暗、溫度20～28 ℃條件下生根培養30 d，之后添加10%無菌毒素并繼續培養30 d，測定株高、根長、新生葉片數、干物質質量。以接種于無毒素培養基的植株為對照。

1.2.3 RAPD檢測 草莓葉片基因組DNA的提取采用CTAB法，向常規CTAB基本提取液中添加1%PVP、1%維生素C、10 mmol/L Na2S2O5、2%β-巰基乙醇[11]。

草莓RAPD-PCR反應體系為：10 mmol/L Tris-HCl（pH值9.0）、50 mmol/L KCl、0.1 mmol/L dNTPs、2.1 mmol/L MgCl2、15 ng引物、20 ng模板、IU TaqDNA聚合酶。反應體積為25 μL。反應程序為：94 ℃預變性4 min；94 ℃ 45 s，37 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，42個循環；72 ℃延伸5 min。將擴增產物在1%瓊脂糖凝膠電泳中電泳，經EB染色后在紫外燈下觀察[12]。endprint

2 結果與分析

2.1 枯萎病菌毒素毒力的測定

經毒素處理的草莓植株可產生與枯萎病相似的癥狀，表明毒素對草莓植株有較強的致病作用，可作為篩選抗枯萎病突變體的選擇劑[13-14]。毒素對草莓植株的毒害作用隨著其濃度的增加而增強。經毒素處理的草莓幼苗根部褐變，葉片邊緣枯萎，株高、根長、葉片數均低于對照，植株長勢衰弱（圖1）。

2.2 毒素選擇壓力的確定

由表1可知，不同劑量毒素對所有品種草莓莖尖的生長均有抑制作用，但品種間差異較大。全明星品種對毒素濃度的變化最為敏感，在10%毒素濃度選擇壓力下，其外植體存活率僅為6.2%，相當于對照處理的6.9%；其次為豐香品種，其外植體存活率在10%毒素濃度選擇壓力下僅為39.8%，相當于對照處理的44.2%；當毒素濃度升至15%時，二者均未檢測到存活的外植體。森格納品種對毒素選擇壓力的抗性最高，當毒素濃度選擇壓力為15%時，其存活率高達45.1%，顯著高于相同濃度下的其他品種。當毒素濃度進一步提升至20%時，森格納品種的存活率仍達到6.2%，而其他品種的外植體則全部褐變死亡?？梢?，15%毒素含量可作為森格納品種草莓抗性突變體的篩選壓力，其余4個品種的選擇壓力則為10%毒素含量。

2.3 抗性不定芽存活率穩定性測定

5個品種的草莓在含毒素培養基上繼代培養3代后，外植體存活率均有所提高（表2）。在毒素含量為10%的培養基上繼代培養3次后，豐香品種存活率上升幅度最大，顯著提高59.6百分點；童子一號、達賽萊克特品種次之，存活率分別提高22.5、20.1百分點；全明星品種無顯著變化。在毒素含量為15%的培養基上繼代培養3次后，森格納、全明星品種存活率上升幅度最大，顯著提高30.0、29.3百分點；豐香、童子一號品種次之，分別提高20.5、17.8百分點；達賽萊克特品種存活率提高幅度最小。對比不同毒素濃度下的繼代培養結果可知，15%毒素濃度下繼代3次培養的草莓抗性不定芽，其存活率均不同程度低于10%毒素濃度。其中，下降幅度最小的全明星品種僅為7.6百分點，而下降幅度最大的達賽萊克特品種達到42.4百分點?？梢?，逐步提高毒素濃度將使外植體的存活率下降，不同品種草莓對毒素的抗性不同。經粗毒素連續篩選得到的抗性不定芽，對枯萎病菌毒素具有較為穩定的抗性。

2.4 抗性不定芽抗毒素分化穩定性測定

對篩選到的5個毒素抗性較強的不定芽進行命名。將全明星品種經篩選得到的2個不定芽分別命名為AS-1、AS-2；將童子一號品種經篩選得到的不定芽命名為TZ-1；將達賽萊克特品種經篩選得到的不定芽命名為DA-1；將森格納品種經篩選得到的不定芽命名為SE-1。對上述5個不定芽進行抗毒素分化能力測定，結果（表3）表明，在相同繼代次數對照培養基培養下，5個抗性不定芽與相應品種野生型不定芽的分化程度無顯著差異。在含有毒素的培養基上培養，AS-1、TZ-1抗性不定芽分化最為穩定，分別高于同品種野生型不定芽49.61%、50.38%；其他3個抗性不定芽的穩定性與同品種野生型不定芽相比顯著提高，平均提高 28.54%。

2.5 草莓抗枯萎病突變體的RAPD分析

選取毒素抗性較好的不定芽進行分子鑒定，提取AS-1、TZ-1、全明星、童子一號品種草莓基因組DNA（圖2），所提取的DNA呈無色透明狀，易溶于TE溶液。草莓基因組DNA在0.7%瓊脂糖凝膠上的電泳結果表明，DNA提取量較多，DNA完整無降解，可直接用于試驗。選用引物OPP-18對全明星、AS-1、童子一號、TZ-1品種草莓基因組DNA進行多態性分析（圖3），樣品在1.4%瓊脂糖凝膠上的電泳結果表明，全明星、AS-1品種的條帶存在差異，在750～1 000 bp 存在特異性條帶。幾次試驗的重復性較高，可擴增得到穩定的特異性條帶，因此可利用引物OPP-18區分全明星、AS-1品種。使用引物OPO-05篩選時并未擴增出特異性條帶，但全明星、AS-1品種的條帶亮度不同（圖4）。選用引物 OPP-18 對TZ-1、童子一號品種草莓DNA進行多態性分析，在1.2%瓊脂糖凝膠上的電泳結果表明，TZ-1、童子一號品種的條帶存在差異，在750～1 000 bp存在特異性條帶。幾次試驗的重復性較高，可擴增得到穩定的特異性條帶。使用引物OPO-05篩選時并未擴增出特異性條帶，而擴增出3條清晰可辨的非特異性條帶。結果表明，所獲得的抗性植株與野生型植株在DNA水平（即堿基）發生了改變，可被認為是突變體。而這些多態性位點是否與抗枯萎病有關仍需進一步鑒定。

3 結論與討論

以毒素作為選擇壓力篩選草莓抗枯萎病突變體時，毒素選擇壓力小不易于篩選出高抗材料；選擇壓力大則導致芽存活率低，不利于篩選工作的進行。多數研究者認為，篩選時采用半致死水平的濃度較為合理[15]。本研究采用草莓枯萎病菌粗毒素處理草莓植株，發現其對植株具有較強的毒害作用，使植株產生與枯萎病相似的癥狀[16]。進一步篩選毒素選擇壓力時發現，采用15%毒素含量（半致死劑量）作為森格納品種的篩選壓力，并采用10%毒素含量作為豐香、童子一號、全明星、達賽萊克特品種的篩選壓力，篩選抗性不定芽時取得了較好的誘導效果，這與前人的研究結論相一致。

目前，大多采用正選擇法從作物中獲得抗病突變體[17]，即確定篩選壓力后逐步遞增毒素濃度，逐步提高外植體的抗性[18]。此方法獲得的材料抗性穩定，避免突變體因無法適應毒素濃度的突然增大而死亡。本研究采用正選擇法得出結論，在15%毒素濃度下繼代3次培養的草莓抗性不定芽，其存活率均不同程度低于10%毒素濃度。其中，下降幅度最小的全明星品種僅為7.6%。對篩選得到的突變體進行室內接種試驗，測定毒素抗性較強的不定芽的分化穩定性。在含毒素的培養基上培養，AS-1、TZ-1抗性不定芽分化最為穩定，分別高于同品種野生型不定芽49.61%、50.38%；因此，在含毒素的培養基上繼代培養可提高不定芽對毒素的抗性。通過RAPD分析可知，TZ-1、童子一號品種的條帶存在差異，在750～1 000 bp存在特異性條帶（1.2%瓊脂糖凝膠電泳）；采用引物OPO-05對其進行篩選，擴增出3條清晰可辨的非特異性條帶，表明所獲得的抗性植株與野生型植株在DNA水平上發生了改變。RAPD檢測到的非特異性條帶是否與枯萎病抗性有關，以及抗性不定芽在田間的抗病表現仍須進一步研究。endprint

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