真空低溫噴霧干燥法制備乳酸菌微膠囊的工藝參數優化

吳德龍　王志耕　梅林　薛秀恒

摘要：乳酸菌是促進人體健康的一類典型益生菌，這類菌要達到其有益效果，活菌數至少應達到100萬CFU/g。由于受到外界與人體胃環境的不良影響，裸露的菌體不易存活，將益生菌進行微膠囊化被認為是最為有效、最有前景的一種保護方法。本研究在單因素研究的基礎上，采用響應面法對真空低溫噴霧干燥制備微膠囊工藝參數進行優化。試驗結果表明，在真空度為-0.05～-0.06 MPa條件下，最佳工藝條件為進風溫度79.07 ℃，進料速度727.54 mL/h，菌壁比1 ∶ 4.55，保護載體（脫脂奶粉）量9.80%，此條件下的活菌數為2.81×108 CFU/g。

關鍵詞：乳酸菌；微膠囊；真空低溫；噴霧干燥法；響應面；活菌數

中圖分類號： TS201.1 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）10-0367-04

乳酸菌是對人體具有重要的生理和保健功能的益生菌，但乳酸菌不形成芽孢，故抗逆性差、易失活而不能很好地發揮其益生功能。 研究乳酸菌保護技術以降低其在食品加工儲藏、人體消化道等過程中的損失具有重要意義。目前，益生菌微膠囊化被認為是最為有效、最有前景的一種方法。微膠囊制備方法有：噴霧成型法、乳化法、擠壓法、共凝聚/相分離法和靜電法等[1]，其中，噴霧成型法制備乳酸菌微膠囊具有干燥速率高、時間短、產品的分散性和溶解性好、生產過程簡單、適用于連續化生產等優勢，成為工業化應用技術研究的重點。本試驗重點研究真空低溫噴霧干燥制備乳酸菌微膠囊技術，優化其工藝參數，為乳酸菌微膠囊生產提供一種低能耗、高活性產品的技術方案。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

嗜熱鏈球菌、乳酸桿菌保存于安徽省農產品加工工程試驗室畜產品加工研究平臺；MRS培養基：杭州微生物試劑有限公司，NaCl：西隴化工股份有限公司；光明脫脂奶粉：光明乳業股份有限公司；麥芽糊精：山東西王糖業有限公司；阿拉伯樹膠粉：國藥集團化學試劑有限公司。

LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；YC-2000實驗室低溫噴霧干燥機：上海雅程儀器設備有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鞏義市予華儀器有限責任公司；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；SW-CJ-2D雙人單面超凈工作臺100級：蘇州凈化設備有限公司；日本日立SEMXL-20型掃描電子顯微鏡。

1.2 試驗方法

1.2.1 生長曲線的測定 以培養時間為橫坐標、測定的D600 nm值為縱坐標，繪制2種菌的生長曲線。

1.2.2 菌懸液的制備 將保存的乳酸菌菌種在MRS固體培養基中活化2次后，接種于新鮮的MRS液體培養基中，37 ℃培養至對數期末、穩定期前。收集穩定期前期的菌液，3 500 r/min離心10min。去上清，將收集到的菌體用無菌生理鹽水洗滌，再次離心，重復3次。用20mL無菌生理鹽水重新懸浮菌體，備用。

1.2.3 工藝流程 將阿拉伯樹膠粉與麥芽糊精按1 ∶ 8[2-3]溶于相應量的去離子水，固形物含量為15%→40 ℃加熱，4 000 r/min高速分散10 min，攪拌至完全溶解→靜置待泡沫消去，加入含2種菌（1 ∶ 1）的20 mL菌懸液，40 ℃加熱，500 r/min攪拌5 min→加入相應量的脫脂奶粉攪拌均勻→設置進料速度與進風溫度，噴霧干燥。

1.2.4 單因素試驗 考察菌壁比、進風溫度、進料速度、保護載體量對活菌數的影響。

1.2.4.1 菌壁比對活菌數的影響 在進風溫度80 ℃、進料速度600 mL/h、保護載體量12.5%，菌壁比（體積比）分別為1 ∶ 2、1 ∶ 4、1 ∶ 6、1 ∶ 8、1 ∶ 10條件下進行5組試驗，每組重復3次。

1.2.4.2 進風溫度對活菌數的影響 在進料速度600 mL/h、菌壁比（體積比）1 ∶ 6、保護載體量12.5%，進風溫度分別為60、70、80、90、100 ℃進行5組試驗，每組重復3次。

1.2.4.3 進料速度對活菌數的影響 在進風溫度80 ℃、菌壁比（體積比）1 ∶ 6、保護載體量12.5%，進料速度分別為200、400、600、800、1 000 mL/h進行5組試驗，每組重復3次。

1.2.4.4 保護載體量對活菌數的影響 在進風溫度80 ℃、進料速度600 mL/h、菌壁比（體積比）1 ∶ 6，保護載體量分別為7.5%、10.0%、12.5%、15.0%、17.5%條件下進行5組試驗，每組重復3次。

1.2.5 活菌數測定 取噴霧干燥得到的粉末0.5 g溶于50 mL滅菌生理鹽水中→37 ℃、180 r/min振蕩1 h至粉末完全溶解→按GB 4789.35—2010《食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》，梯度稀釋涂平板，得活菌數。

1.2.6 電鏡掃描 對經冷凍干燥預處理的裸菌和噴霧干燥粉末電鏡掃描，觀察微觀結構。

1.2.7 響應面分析 在單因素試驗的基礎上，根據Box-Benhnken的中心組合試驗設計原理，以進風溫度、進料速度、菌壁比、保護載體量為自變量，活菌數的對數值為響應值，利用響應面法分析優化真空低溫噴霧干燥制備乳酸菌微膠囊工藝參數。響應面因素和水平設計見表1。

1.2.8 數據統計分析 將試驗結果利用Excel、Design-Expert 8.0進行直觀分析和方差分析。

2 結果與分析

2.1 生長曲線

從圖1可以看出，嗜熱鏈球菌在16 h后基本完成對數期，故選擇培養時間為16 h；同理乳酸桿菌選擇培養18 h（圖2）。

2.2 單因素試驗

2.2.1 菌壁比對活菌數的影響 從圖3可以看出，芯材與壁材在一個合適的比例得到的活菌數最高。菌壁比過高，芯材不能完全被包覆，包埋率下降，裸露的菌體在高溫下失活，活菌數降低。菌壁比過低，一方面降低單位體積的菌濃度，另一方面降低壁材利用率。本研究選擇菌壁比1 ∶ 4左右較為合適。endprint

2.2.2 進風溫度對活菌數的影響 在噴霧干燥工藝中進風溫度是主要考慮的因素之一[4-6]，從圖4可以看出，隨著進風溫度的升高，活菌數總體呈下降趨勢，60～80 ℃下降緩慢，80 ℃以后急劇下降。60～70 ℃時噴出的粉末含水率接近5%，不利于后期貯藏；而當溫度升高至80 ℃時粉末的含水量降為3.9%，符合GB/T 5410—2008《乳粉（奶粉）》。溫度超過80 ℃使活菌數急劇下降，因此選擇進風最佳溫度80 ℃左右。

2.2.3 進料速度對活菌數的影響 在噴霧干燥過程中，進料速度越快，即單位時間內要被霧化器霧化為小液滴的物料就越多，將料液干燥轉化為粉粒時所需的熱量就越多。因此，在其他因素一定的條件下，即單位時間內，熱風提供給物料的熱量一定時，進料速度越大，干燥效果就越差[7]。另一方面本研究的芯材為生物活性物質，干燥時間越長，失活程度越大。從圖5可以看出，進料速度為200～600 mL/h時，物料與熱風接觸時間過長，隨著進料速度加快，活菌數上升。進料速度為600～1 000 mL/h，進料速度過快，隨著進料速度的加快，干燥效果變差，活菌數下降。故選擇進料速度為600 mL/h。

2.2.4 載體量對活菌數的影響 添加載體可帶走一部分水分蒸發的熱，減少熱對內部微生物的傷害，相關研究表明，脫脂奶粉在與其他載體相比較時，具有優越性[5]。從圖6可以看出，脫脂奶粉含量7.5%～10.0%時，隨著脫脂奶粉含量的增加，溶液黏度有規律遞增，體系穩定，且水分蒸發時可帶走體系一部分熱量，使活菌數上升。脫脂奶粉含量10.0%～17.5%時，隨著脫脂奶粉含量的增加，溶液固形物含量偏高，出現粘壁現象，活菌數下降。故選擇載體量10.0%為最佳。

2.3 響應面優化結果分析

2.3.1 顯著性分析 Box-Benhnken試驗設計及結果見表2，各因素經回歸擬合，得出二次回歸方程：

Y=-8.45+0.007 5A+0.019B+0.022C+0.005D+0002 5AB+0.017AC-0.007 5AD-0.01BC-0.015BD-0037CD-0.038A2-0.036B2-0.022C2-0.12D2。

從表3可以看出，模型的P值0.05，不顯著，該資料適用于二次項擬合。該模型的R2為93.53%，修正后87.06%，說明該模型能解釋8706%的響應值變化，該模型與實際的擬合性較好。

從表3方差分析可以看出，菌壁比、載體量對活菌數的影響不顯著，進風溫度對活菌數的影響顯著，進料速度對活菌數的影響極顯著，表明進風溫度與進料速度對活菌數的影響呈較明顯的線性關系；進料速度與載體量之間交互作用極顯著，其他各因素之間的交互作用均不顯著，說明進料速度與載體量相互影響，不是簡單的主效應疊加；進料速度的二次項對活菌數的影響顯著，菌壁比、進風溫度、載體量的二次項對活菌數的影響極顯著，說明該模型中的二次項與活菌數并不是簡單的線性關系而是拋物線關系，這點可以從單因素看出。

剔除對回歸方程不顯著的、貢獻率不大的因素，得到二次回歸方程如下：

Y=8.45+0.019B+0.022C-0.037CD-0.038A2-0.036B2-0.022C2-0.12D2。

得到最佳工藝條件為菌壁比1 ∶ 4.76、進風溫度 79.52 ℃、進料速度714.47 mL/h、載體量9.82%。在此工藝參數條件下，產品活菌數2.88×108 CFU/g。

從表3可以看出，各單因素對活菌數的影響大小排序為進料速度>進風溫度>菌壁比>載體量。

2.3.2 響應面立體圖分析 由回歸方程得出擬合的進料速度與載體量對活菌數的影響的響應面見圖7。表示當進風溫度和菌壁比為零水平時，進料速度和載體量對活菌數的影響。響應曲面的坡度陡峭程度反映了因素對響應值的影響力大小，表明因素間交互作用的強弱。從圖7可以看出，進料速度與載體量之間的交互作用顯著。 圖8為等高線圖，等高線的形狀反映出交互效應的強弱，越趨向橢圓表明交互作用越強，越趨向圓形則相反，表明交互作用越弱[8]。從圖8可以看出二者交互作用強。

2.4 電鏡掃描圖片與菌粉圖

電鏡條件為加速電壓3 kV，工作距離8.2 mm。3 000倍

電鏡掃描的圖片見圖9，左圖是微膠囊處理前，右圖是微膠囊處理后。8 000倍電鏡掃描圖片見圖10，左圖是微膠囊處理前，右圖是微膠囊處理后。對比可知乳酸菌包被效果良好，微膠囊的微觀結構呈凹面空腔，表現為“扁球效應”[9-10]。

噴霧干燥后的粉末樣見圖11，樣品呈淡黃色，質感細膩，有淡淡乳香。

2.5 最佳工藝條件的預測和驗證

根據試驗所得模型預測出理論條件下低溫真空噴霧干燥制備微膠囊的最佳工藝條件為：菌壁比1 ∶ 4.55，進風溫度

79.07 ℃，進料速度727.54 mL/h，載體量9.80%，活菌數288×108 CFU/g。按最佳組合工藝參數重復試驗3次，得實際活菌數2.81×108 CFU/g，與預測值的相對偏差小于3%。因此，基于響應面法得到的優化工藝參數準確可靠，有實用價值。

3 結論

研究在單因素試驗的基礎上，通過響應面試驗設計對低溫噴霧干燥制備乳酸菌微膠囊的工藝進行了優化。優化結果表明，菌壁比、進風溫度、進料速度、載體量4個因素對噴霧干燥制備乳酸菌微膠囊的影響大小依次為：進料速度>進風溫度>菌壁比>載體量，最佳工藝條件為菌壁比1 ∶ 4.55，進風溫度79.07 ℃，進料速度727.54 mL/h，載體量9.80%，此條件下得到的微膠囊活菌數為2.81×108 CFU/g，滿足一般產品加工要求。

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