龍葵對鎘污染土壤的響應及其修復效應研究

孫正國

摘要：以礦區不同范圍內（對照組、市內、礦區周邊農田、礦區邊緣、礦區和尾礦）土壤為培養基質盆栽重金屬超富集植物龍葵（Solanum nigrum），研究其對鎘污染土壤修復效應。結果發現：不同樣地土壤含鎘量不同，土壤中鎘含量（Cd >20 mg/kg）遞增對龍葵生長和光合作用產生明顯負面影響，如生物量遞減、光合效率降低。其次，龍葵在鎘污染土壤的脅迫下，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、丙二醛（MDA）含量增加。此外，土壤中鎘含量的增加龍葵中與鎘轉運有關的基因表達水平也顯著增加。以上結果表明，過量的鎘對龍葵的生長發育有負面影響，促進植物體有害物質（過氧化物和MDA）的積累，同時龍葵自身也通過合成相關的酶清除體內有害物質，減輕損害，如通過快速合成相關鎘轉運蛋白，增強龍葵對土壤中鎘的吸收和積累，從而減少土壤中鎘的含量。

關鍵詞：龍葵；鎘污染；有害物質積累；基因表達；Real-time PCR；光合作用；抗氧化酶

中圖分類號： X53 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）10-0397-05

近十幾年來，我國金屬礦山開采高速發展，礦山周邊土壤受到重金屬污染日益嚴重[1-2]。造成土壤污染的重金屬主要包括As、Cd、Hg、Pb、Cu、Zn、Co、Mn、Ni、Cr等，其中鎘污染是最常見的重金屬污染之一，在土壤中具有較強的化學活性，與其他重金屬相比，更易被植物吸收，具有很強的從土壤向植物遷移的能力[3-6]。土壤中鎘含量過多將會使植物受到嚴重毒害，植物表現為生長緩慢、植株矮小、褪綠等中毒癥狀，其細胞的膜透性、光合代謝、呼吸代謝、酶代謝、遺傳效應等也發生改變，生物量下降[7-9]。如何消除土壤環境中的重金屬污染物已經成為國際性難題。因此，20世紀80年代初期發展起來的利用植物修復（phytoremediation）技術修復鎘污染土壤的研究逐漸成為研究熱門，相對于傳統的重金屬污染土壤治理方法，如換土法、淋洗法、化學氧化法等，植物修復技術具有經濟、環保綠色的優勢，因而具有極大的潛力[10-12]。重金屬污染土壤的植物修復主要是指利用超富集植物（hyperaccu-mulator）的提取作用將土壤中超量的重金屬去除，從而達到清潔污染土壤的目的[13]。目前，香根草、續斷菊、蜈蚣草、鱗苔草、印度芥菜、龍葵等都是重金屬超富集型植物。龍葵作為新型重金屬超富集植物對鎘具有較強的耐受性，主要通過螯合作用，限制鎘的吸收和在植物體內的運輸，區域化以及相應酶的解毒作用，也通過形成對鎘高度親和的高分子量絡合物或是調節相關重金屬轉運蛋白來實現對鎘的聚集和解毒。本試驗以新型鎘超富集植物龍葵為材料，研究了不同濃度鎘污染土壤對龍葵植株生理生長、抗氧化系統、光合作用等生理特性和鎘吸收積累特性的影響，探討了鎘脅迫下超富集植物龍葵的生理響應機制以及龍葵對鎘污染土壤的修復基質。

1 材料與方法

1.1 樣地概況

銅山口礦區地處長江中下游銅鐵成礦帶西端，位于湖北省大冶市境內，屬于我國典型的露天開采的中型銅礦，該礦床為矽卡巖斑巖復合型礦床。礦區坐標是141°50′217″E、30°0′35″N。該礦床主要出產有色金屬礦Cu，經調查發現夾含少量各類重金屬，如As、Cd、Hg、Pb、Zn、Co、Mn、Ni、Cr等。

1.2 試驗設計與方法

1.2.1 采集樣地及樣品理化性質測定 2013年6月分別采集尾礦、礦區、礦區邊緣、礦區周邊農田、大冶市內以及對照土壤，樣品袋保存，于實驗室分揀粗砂、枯枝爛葉等雜質，自然風干。pH值采用電極電位法測定（1 ∶ 2.5土水比）；土壤全氮（g/kg）用凱氏定氮法測定；土壤全磷（g/kg）用 NaOH 熔融-鉬銻抗比色法測定；根莖葉果實中鎘含量用HNO3-H2O2微波消解（CEM MARS-5）-原子吸收法（TAS-990普析通用原子吸收分光光度計）測定，用植物樣本（GBW08510）進行質量分析；土壤中鎘含量用鹽酸-硝酸-氫氟酸-高氯酸消解-原子吸收法測定，用土壤標樣（GBW08303）進行質量分析[14-16]。

1.2.2 龍葵光合及生理生長指標測定 2013年8月，用直尺測量并記錄龍葵株高；分別收獲龍葵根、莖、葉和果實，測量鮮質量，并于120 ℃烘箱殺青2 h，再調至80 ℃烘烤48 h，分別稱量干質量。在龍葵培養期間，每隔1個月，用便攜式調制葉綠素熒光儀PAM-2500（Walz，德國） 進行葉綠素熒光參數的測定。每個處理重復選取至少3張活體全葉葉片進行暗適應30 min，檢測時先用測量光（0.5 μmol/m2·s） 測定初始熒光Fo，飽和光脈沖2 700 μmol/（m2·s）（脈沖時間0.8 s）誘導Fm，光化光強度為186 μmol/（m2·s），主要測量能夠反映光合系統Ⅱ（PSⅡ）活性的初始熒光強度（Fo）、最大原初始光能轉換效率（Fv/Fm）、最大電子傳遞速率（ETR），以及反映植物熱耗散能力的PSⅡ非光化學淬滅系數（qN）。

1.2.3 龍葵抗氧化系統酶活測定 參照李合生的方法[17]測定丙二醛（MDA）含量。超氧化物歧化酶（SOD）活性的測定采用NBT光還原法，利用SOD對氮藍四唑（NBT）的光抑制作用，在560 nm處測定吸光度[18]。計算公式如下：

SOD活性（U/g）=樣品液體積×（對照管D-樣品管D）/對照管D加入酶液的量×50%樣品鮮質量。

1.2.4 鎘轉運相關基因的表達變化 RNA提?。悍謩e剪取新鮮的龍葵葉片，參考Q-Biogene 公司的RNA提取試劑盒（FastRNA Pro Green Kit） 提取RNA。

cDNA合成：參考Invitrogen公司反轉錄試劑盒（Superscript Ⅱ）合成cDNA。

Real Time-PCR：參考Applied Biosystems 公司的Power Sybr Green PCR Master Mix（10 μL） 說明，構建反應體系。PCR引物如表1。endprint

通過 Real-time PCR 試驗，得出所有基因的CT值。以 GAPDH 和 TUBULIN 基因為內參基因，計算出ΔCT。在市內、礦區周邊農田、礦區邊緣、礦區及尾礦龍葵基因表達的分析中，以 MT2A基因的表達為定標。在對照組龍葵基因表達的分析中，以PCS基因為定標。計算出ΔΔCT并作記錄，通過下列公式計算RQ：

RQ=2-ΔΔCT。

1.3 數據分析

采用SPSS 16.0數據分析軟件進行數據處理，運用最小顯著差數法（LSD）進行顯著性分析。用OriginPro 7.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 樣地土壤理化性質

礦區不同區域內土壤pH值差異顯著，總體上呈現越靠近礦區土壤pH值越小，酸度越大的趨勢（表2）。農田中因農作物生長需要，認為施肥較多，土壤中氮磷含量較其他地區差異顯著，對照組和市內土壤之間，礦區外緣、礦區以及尾礦土壤之間氮磷含量差異都不顯著。不同區域土壤中重金屬鎘含量差異極顯著，其中礦區周邊農田、礦區外緣、礦區及尾礦顯著超出國家土壤鎘含量最低三級標準（≤1.0 mg/kg）標準值，尾礦中的礦物經處理后的殘渣中鎘含量更是高于標準值200倍，其礦區周邊的農田土壤中鎘含量也超標，受到污染。

2.2 龍葵生理生長及光合特性

隨著供試土壤中鎘含量的增加，龍葵受到脅迫程度也在增加，主要表現為生長緩慢、高度變低、各部分生物量減小，尤其是礦區和尾礦土壤所栽培的龍葵株高及生物量較其他區域土壤栽培龍葵差異明顯 （表3）。同時，鎘含量的增加引起PSⅡ反應系統中初始熒光水平（Fo）的增加，而最大原初光能轉化效率（Fv/Fm）、最大電子傳遞速率（ETR）明顯降低（圖1），說明PSⅡ反應系統遭受破壞或可逆失活。此外，植物捕光色素吸收光能后以熱的形式耗散過剩激發能的能力（qN）也明顯上升，說明它們啟動熱耗散來消耗過量的激發能，以減輕重金屬鎘脅迫對其光合系統的損傷。

2.3 龍葵對鎘的富集特性

經過8個月的生長，測定培養基質土壤理化性質，各區域土壤較采樣前土壤pH值，總氮磷含量變化不明顯，生長過程中噴施霍格蘭式營養液，氮磷含量略有變化，而各區域土壤中鎘含量有明顯減少，說明這段時間內土壤中鎘有轉移（表4）。再對龍葵各部分鎘含量進行測定，龍葵中鎘含量明顯增加，說明其吸收了土壤中的鎘并富集在植物的不同組織，根吸收水分和營養元素，同時也能吸附土壤當中的鎘，再通過向上運輸富集在營養器官果實中，因此根和果實中富集鎘最多，葉莖次之，而且檢測發現龍葵對鎘的吸收多少可能和所生長土壤當中的鎘含量有顯著相關，當土壤中鎘含量較高時，龍葵容易吸收富集更多的鎘（圖2）。

2.4 龍葵SOD和MDA的積累

土壤中的鎘含量達到一定的濃度時會對植物生長產生影響，誘導植物細胞產生過量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）[19-22]，例如超氧化物 O-2 · 和過氧化氫（H2O2）等，同時植物會啟動自身防御，產生多種抗氧化酶（如SOD），清除過氧化物[23-26]；還可能引起細胞過氧化反應，產生過多的MDA，毒害植物細胞[27]。在不同鎘含量土壤中生長的龍葵MDA含量不同，呈現土壤中鎘含量越高，龍葵吸收鎘越多，產生的MDA越多，對植物毒害越大（圖3）。在對不同土壤中生長龍葵細胞內SOD活性測定發現，植物細胞中SOD積累與鎘含量大小有關，鎘含量大，植物體內過氧化物積累增多，相應SOD活性增強，緩解過氧化物積累對植物細胞產生的損害（圖4）。

2.5 與鎘吸收轉運有關基因的表達

P型ATP酶（P type-ATPase）中HMA亞族能夠轉運多種必需金屬以保證植物從土壤中吸取足夠的養分，然而這些金屬轉運體在轉運必需元素的同時，也大多可以參與鎘等有毒重金屬離子吸收轉運[28-30]；HVMT基因家族中HVMT-1，HVMT-3，HVMT-4等參與植物金屬硫蛋白的表達，而金屬硫蛋白能與有毒重金屬離子結合[31]。Real-time PCR實時監測龍葵中與鎘吸收轉運有關基因（P type-ATPase，HVMT-1，HVMT-3，HVMT-4）的表達。不同鎘含量土壤中龍葵的四種鎘轉運基因表達具有相似性，鎘含量越高、基因表達增強，對鎘的吸收也增多，尾礦>礦區>礦區邊緣>礦區周邊農田>市內>對照組（圖5）。

3 討論

過量的非必需重金屬鎘嚴重抑制植物生長，對植物產生毒害作用[32-33]，通常鎘會降低植物對水分脅迫的耐性，在相對水分含量和葉片水勢較高時使膨壓喪失，影響植物對水分吸收并引起根部的損傷[34]。鎘是光合作用的一種有效抑制劑，鎘進入植物體內，影響光合色素的合成，降低葉綠素含量，影響并破壞光合系統[35]。此外，植物吸收過量的鎘會誘導植物產生過氧化氫類物質，對植物細胞產生毒害，導致酶活性喪失，生物膜破壞或生物氧化脅迫[36-37]。同樣的植物也會產生相應的緩解機制，例如產生超氧化物歧化酶等消除植物細胞中過多的過氧化物，上調或下調相關基因表達或是合成與重金屬結合的金屬硫蛋白和螯合蛋白等[38]。

在本試驗中，土壤鎘含量越大，龍葵吸收的鎘也增多，而鎘也會對龍葵的生理生長和光合特性產生較顯著影響，隨著鎘龍葵體內鎘含量積累，過量的鎘可能減弱細胞分裂增長從而影響龍葵的株高、根長和生物量等生理指標。龍葵葉片收到鎘脅迫，PSⅡ反應系統中初始熒光水平顯著增大，最大原初光能轉化效率、最大電子傳遞速率顯著降低，這說明PSⅡ反應系統遭受破壞或可逆失活。同樣，植物捕光色素吸收光能后以熱的形式耗散過剩激發能的能力也顯著上升，它以這種形式來緩解鎘對植物體的損傷。試驗中龍葵體內鎘含量的積累還導致植物細胞的氧化脅迫，使植物體內產生過多的活性氧和 MDA，損傷植物DNA、膜脂蛋白等，加速細胞衰老和凋亡[4，39-40]。然而當龍葵受到鎘脅迫時，立即合成各種抗氧化酶，如SOD、CAT、POD，這些酶能有效地將植物細胞內的過氧化物還原成H2O，緩解過氧化物過多引起的損傷。比較8月份收獲的龍葵葉片中各鎘轉運基因的表達水平差異，與重金屬鎘轉運有關的基因（P type-ATPase）及合成金屬硫蛋白有關基因（HVMT-1，HVMT-3，HVMT-4）都隨鎘的積累明顯上調，這與重金屬鎘的誘導有關，龍葵通過上調鎘轉運基因的表達，更有效率地吸收土壤的養分及重金屬離子，導致龍葵體內鎘的快速積累。另一方面，又通過上調合成金屬硫蛋白相關基因表達，快速合成金屬硫蛋白螯合重金屬鎘離子，緩解減弱鎘對龍葵的損傷。endprint

龍葵通過自身精細的調節，一邊有效吸收富集土壤中的鎘，一邊又快速合成相關蛋白消除或減弱鎘對自身的傷害，雖然植物抗鎘脅迫的機理已取得了階段性的進展[41-42]，但是還有許多細節的調控不清晰，目前未發現植物體內特異轉運重金屬鎘的蛋白的相關報道，龍葵對鎘吸收及抗逆性精細調控信號通路也不完善，這都是未來要努力的方向。本研究針對超富集植物龍葵在對鎘污染響應及土壤的修復有良好的效應，對植物修復土壤中有害重金屬有借鑒意義。

參考文獻：

[1]周濤發，李湘凌，袁 峰，等. 金屬礦區土壤重金屬污染的植物修復研究現狀[J]. 地質論評，2012，54（4）：515-522.

[2]王崇臣，王 鵬，黃忠臣. 盆栽玉米和大豆對鉛、鎘的富集作用研究[J]. 安徽農業科學，2008，36（24）：10383-10383，10386.

[3]陳圣安. 鎘污染對水稻生理生化的影響[J]. 農技服務，2011，28（7）：1033-1035.

[4]Zeng X W，Qiu R L，Ying R R，et al. The differentially-expressed proteome in Zn/Cd hyperaccumulator Arabis paniculata Franch. in response to Zn and Cd[J]. Chemosphere，2011，82（3）：321-328.

[5]Küpper H，Lombi E，Zhao F J，et al. Cellular compartmentation of cadmium and zinc in relation to other elements in the hyperaccumulator Arabidopsis halleri[J]. Planta，2000，212（1）：75-84.

[6]Satarug S，Baker J R，Urbenjapol S，et al. A global perspective on cadmium pollution and toxicity in non-occupationally exposed population[J]. Toxicology Letters，2003，137（1/2）：65-83.

[7]秦 麗，祖艷群，等. 鎘對超級累植物續斷菊生長生理的影響[J]. 農業環境科學學報，2010，29（1）：48-52.

[8]劉建新. 鎘脅迫下玉米幼苗生理生態的變化[J]. 生態學雜志，2005，24（3）：265-268.

[9]魏樹和，周啟星，王 新，等. 雜草中具重金屬超積累特征植物的篩選[J]. 自然科學進展，2003，13（12）：29-35.

[10]周乃元，王仁武. 植物修復——治理土壤重金屬污染的新途徑[J]. 中國生物工程雜志，2002，22（5）：53-57.

[11]Zhang Y，Peng B Z，Gao X，et al. Degradation of soil properties due to erosion on sloping land in southern Jiangsu Province，China[J]. Pedosphere，2004，14（1）：17-26.

[12]Glass D J. 1999. U.S. and International Markets for Phytoremediation，1999-2000[R].

[13]Susarla S，Medina V F，Mccutcheon S C. Phytoremediation：an ecological solution to organic chemical contamination[J]. Ecological Engineering，2002，18（5）：647-658.

[14]張 晶，蘇德純. 不同鎘污染農田土壤上秸稈和炭化秸稈分解動態及其對土壤鎘的吸附特征[J]. 環境工程學報，2013，7（10）：4097-4102.

[15]孟令陽，辛術貞，蘇德純. 不同惰性有機碳物料對土壤鎘賦存形態和生物有效性的影響[J]. 農業環境科學學報，2011，30（8）：1531-1538.

[16]周建斌，鄧叢靜，陳金林，等. 棉稈炭對鎘污染土壤的修復效果[J]. 生態環境，2008，17（5）：1857-1860.

[17]Li H S. The principle and technology of plant physiological and biochemical experiments[M]. Beijing：Higher Education Press，2005.

[18]Zhang H，Jiang Y，He Z，et al. Cadmium accumulation and oxidative burst in garlic（Allium sativum）[J]. Journal of Plant Physiology，2005，162（9）：977-984.

[19]Heyno E，Klose C，Krieger-Liszkay A. Origin of cadmium-induced reactive oxygen species production：mitochondrial electron transfer versus plasma membrane NADPH oxidase[J]. New Phytologist，2008，179（3）：687-699.endprint

[20]Mijaljica D，Prescott M，Devenish R J. Microautophagy in mammalian cells：revisiting a 40-year-old conundrum[J]. Autophagy，2011，7（7）：673-682.

[21]Mithofer A，Schulze B，Boland W. Biotic and heavy metal stress response in plants：evidence for common signals[J]. FEBS Letters，2004，566（1/2/3）：1-5.

[22]Shapiguzov A，Vainonen J P，Wrzaczek M，et al. ROS-talk-how the apoplast，the chloroplast，and the nucleus get the message through[J]. Frontiers in Plant Science，2012，3：292-305.

[23]王宇濤，陳志勇，曾琬淋，等. 擬南芥對鎘脅迫的生理響應[J]. 華南師范大學學報：自然科學版，2014，46（2）：99-107.

[24]薛 鑫，張 芊，吳金霞. 植物體內活性氧的研究及其在植物抗逆方面的應用[J]. 生物技術通報，2013（10）：6-11.

[25]Qin R，Jiang W S. Liu D H. Cadimum can induce alterations in the cellular localization and expresstion of three major nucleolar proteins in root tip cells of Vicai faba[J]. Plant and Soil，2013，368（1/2）：365-373.

[26]Alscher R G，Erturk N，Heath L S. Role of superoxide dismutases （SODs） in controlling oxidative stress in plants[J]. Journal of Experimental Botany，2002，53（372）：1331-1341.

[27]Gao C H，Hu J，Zhang S，et al. Association of polyamines in governing the chilling sensitivity of maize genotypes[J]. Plant Growth Regulation，2009，57（1）：31-38.

[28]Schützendübel A，Schwanz P，Teichmann T，et al. Cadmium-induced changes in antioxidative systems，hydrogen peroxide content，and differentiation in Scots pine roots[J]. Plant Physiology，2001，127（3）：887-898.

[29]Nickson R，Mcarthur J，Burgess W，et al. Arsenic poisoning of Bangladesh ground water[J]. Nature，1998，5：395-338.

[30]Malgorzata W，Jaco V，Anna T. Cadmium tolerance in Thlaspi caerulescens I. Growth parameters，metalaccumulation and phytochelatin synthesis in response to cadmium[J]. Environmental and Experimental Botany，2005，53：151-161.

[31]魏樹和，周啟星，王 新. 超積累植物龍葵及其對鎘的富集特征[J]. 環境科學，2005，26（3）：167-171.

[32]Dally H，Hartwig A. Induction and repair inhibition of oxidative DNA damage by nickel（Ⅱ） and cadmium（Ⅱ） in mammalian cells[J]. Carcinogenesis，1997，18（5）：1021-1026.

[33]Song W Y，Sohn E J，Martinoia E，et al. Engineering tolerance and accumulation of lead and cadmium in transgenic plants[J]. Nature Biotechnology，2003，21（8）：914-919.

[34]Sanità Di Toppi L，Gabbrielli R. Response to cadmium in higher plants[J]. Environmental and Experimental Botany，1999，41（2）：105-130.

[35]Schützendübel A，Polle A. Plant responses to abiotic stresses：heavy metal-induced oxidative stress and protection by mycorrhization[J]. Journal of Experimental Botany，2002，53（372）：1351-1365.

[36]Cai Y，Cao F，Cheng W，et al. Modulation of exogenous glutathione in phytochelatins and photosynthetic performance against cd stress in the two rice genotypes differing in Cd tolerance[J]. Biological Trace Element Research，2011，143（2）：1159-1173.

[37]Das P，Samantaray S，Rout G R. Studies on cadmium toxicity in plants：a review[J]. Environmental Pollution，1997，98（1）：29-36.

[38]Guo W J，Meetam M，Goldsbrough P B. Examining the specific contributions of individual Arabidopsis metallothioneins to copper distribution and metal tolerance[J]. Plant Physiology，2008，146（4）：1697-1706.

[39]陳圣安. 鎘污染對水稻生理生化的影響[J]. 農技服務，2011，28（7）：1033-1035.

[40]李夢梅，龍明華. 植物抗鎘脅迫的研究綜述[J]. 廣西農業科學，2005，36（4）：319-322.

[41]李開軍. 常見重金屬土壤污染及植物修復研究進展[J]. 綠色科技，2011（12）：132-135.

[42]Roosens N H，Leplae R，Bernard C，et al. Variations in plant metallothioneins：the heavy metal hyperaccumulator Thlaspi caerulescens as a study case[J]. Planta，2005，222（4）：716-729.endprint