1株溶磷細菌P0417的溶磷機制

管國強　李倩　季蓉蓉　陳菊　錢靜亞　黃達明

摘要：以Ca3（PO4）2為磷源，研究溶磷細菌伯克霍爾德氏菌P0417產生的有機酸和磷酸酶對其溶磷效果的影響，探討溶磷細菌P0417的溶磷機制。結果發現，溶磷細菌P0417液體搖瓶培養5 d后，溶磷量達503.53 μg/mL；溶磷細菌P0417產生的有機酸包括草酸、酒石酸、蘋果酸、丙酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸，濃度總量達420.59 mg/L；有機酸的溶磷量為493.89 μg/mL，磷酸酶粗酶液的溶磷量為18.37 μg/mL。結果表明，溶磷細菌P0417的溶磷機制主要是通過分泌有機酸進行溶磷的。

關鍵詞：溶磷細菌；機制；有機酸；磷酸酶

中圖分類號： Q935 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）10-0432-03

磷在農業中起重要的作用，但也是農業生產中重要的限制因素之一。磷在土壤中的存在形式主要以難溶性磷酸鹽為主，不易被作物吸收，因此無法滿足一般作物的生長需求。在堿性土壤中，難溶性磷鹽主要為Ca3（PO4）2，酸性土壤中主要的磷鹽為FePO4、AlPO4[1-2]。土壤中的一些微生物具有溶解難溶性磷酸鹽的活性，主要包括細菌、真菌、放線菌等[3]。不同的微生物溶磷能力有較大的差異，其溶磷量在1421～643.2 μg/mL之間[4-6]。土壤溶磷微生物不僅可以提高植物對磷的利用效率，改善植物營養條件，增加抗病能力[7]；而且還可以改善土壤結構，提高有機質含量，改良鹽堿地，對培育和充分發揮土壤生態肥力、保持農業生態環境的平衡等均具有極其重要的作用[8]。

有關溶磷微生物的研究和應用已有多年，但其溶磷機理還不十分清楚，從而極大地限制了溶磷微生物的生產應用[9]。筆者所在的課題組前期已經從桂花樹根際土壤中篩選出1株具有溶磷功能的細菌，經鑒定為德克霍爾德氏菌P0417，本研究從該溶磷菌對Ca3（PO4）2的溶磷作用出發，探討溶磷菌產生的有機酸和磷酸酶對溶磷量的影響，完善溶磷菌的溶磷機理，為提高溶磷菌對難溶性磷的利用效率、開發溶磷微生物肥料等提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

菌株P0417由筆者所在的實驗室自行篩選，鑒定為德克霍爾德氏菌。

1.2 培養基

PKO培養基：10 g Ca3（PO4）2，10 g葡萄糖，0.3 g MgSO4·7H2O，0.3 g NaCl，0.3 g KCl，0.03 g FeSO4·7H2O，0.03 g MnSO4·4H2O，0.5 g （NH4）2SO4，pH值7.0～7.2，1 000 mL水。Ca3（PO4）2單獨滅菌后加入。

1.3 主要試劑及配制方法

供液相分析用有關試劑均為分析純，流動相水為娃哈哈純凈水。

供液相分析用標準樣品的配制：0.01 mg/mL酒石酸，0.1 mg/mL 草酸，0.005 mg/mL蘋果酸，0.02 mg/mL檸檬酸，0.000 5 mg/mL乙酸，0.01 mg/mL丙酸，0.002 5 mg/mL琥珀酸。

改進的通用緩沖試劑（MUB）儲備液的配制：12.1 g三羥甲基氨基甲烷（Tris），11.6 g順丁烯二酸，7 g檸檬酸和6.3 g硼酸于488 mL 1 mol/L NaOH溶液中，用水稀釋至1 L，儲存于冰箱中。

改進的通用緩沖試劑（MUB）的配制：取200 mL MUB儲存液于500 mL燒杯中，用0.1 mol/L HCl滴定到溶液中使pH值為6.5，再用水定容至1 L。用0.1 mol/L NaOH滴定另一份200 mL MUB儲備液使其pH值為11，然后用水定容至1 L。

0.025 mol/L對硝基苯磷酸二鈉溶液的配制：溶解 0.630 g 對硝基苯磷酸二鈉于40 mL改進的通用緩沖液中，緩沖液pH值為6.5時用于檢測酸性磷酸酶，pH值為11時用于檢測堿性磷酸酶，用相同pH值的MUB儲備液將溶液稀釋到50 mL，放置冰箱中，現配現用。

1.4 有機酸的測定

液相色譜分離條件：色譜柱為Hypersil C18（250 mm×4.6 mm）；流動相為0.02 mol/L KH2PO4緩沖溶液—甲醇溶液（98% ∶ 1%），用1 mol/L磷酸調節pH值至2.6，紫外檢測波長210 nm；進樣量10 μL，流速0.5 mL/min，柱溫為室溫。

1.4.1 有機酸標準品的定性定量測定 將7種有機酸標準品按上述色譜分離條件在高效液相色譜上樣，分別得出其出峰時間。并將不同濃度的有機酸標準液進樣，以峰面積為縱坐標，以有機酸濃度作為橫坐標繪制標準曲線對其定量分析。

1.4.2 發酵液中有機酸的定性定量測定 將菌株用LB液體培養基制成菌懸液（濃度約為10 億個/mL，即波長600 nm，D值1.0），按菌懸液與PKO液體培養基比例為 1 ∶ 100 接種，即每100 mL培養基接菌懸液1 mL，以不接菌空白PKO液體培養基為對照，在28 ℃、150 r/min條件下搖床培養120 h。取發酵液2 mL，10 000 r/min離心，再經0.22 μm濾膜真空抽濾后上液相色譜，將其圖譜與標準樣品圖譜進行比對。

1.4.3 有機酸對磷酸鈣的溶解作用 人工模擬配制菌株P0417發酵產生的有機酸，即向與發酵液相同濃度的有機酸混合溶液加入與培養基同質量的Ca3（PO4）2于三角瓶中，與接菌的培養基在相同條件下培養120 h，做3組平行試驗，以不加有機酸溶液為空白對照組，測定溶磷量[10-11]。

1.5 磷酸酶活性測定

1.5.1 發酵液中磷酸酶活性的測定[12] 標準曲線的繪制：取6支試管，依次吸取l g/L標準對硝基酚溶液0、1、2、3、4、5 mL 分別裝于試管中，用無菌水定容至5 mL，在每個試管中再加入1 mL 0.5 mol/L氯化鈣和4 mL 0.5 mol/L氫氧化鈉，振蕩后過濾，測定420 nm條件下濾液吸光度。以1 h 1 L發酵液中作用于底物并釋放出產物的微摩爾數稱為1個酶活力單位，記為μmol/（L·h）。endprint

吸取1 mL發酵液，加入4 mL pH值為6.5的MUB，再加l mL 0.025 mol/L對硝基苯磷酸二鈉溶液，振蕩幾秒鐘。塞住瓶塞，37 ℃條件下培養l h后，加入1 mL 0.5 mol/L氯化鈣和4 mL 0.5 mol/L氫氧化鈉，振蕩后用折疊濾紙過濾懸液。將澄清濾液在420 nm比色。此為酸性磷酸酶活性測定方法，堿性磷酸酶時所用MUB試劑pH值為11。

1.5.2 發酵液中磷酸酶對磷酸鈣的溶解作用

1.5.2.1 磷酸酶粗酶液的制備及分離純化 按“1.4.2”節的方法接菌振蕩培養72 h，并參照黃毅等的方法[13-14]略加修改，取發酵液過濾后濾液在4 ℃、12 000 r/min條件下離心20 min，收集上清液；向其中加入硫酸銨至40%飽和度，4 ℃靜置3 h后，4 ℃、12 000 r/min條件下離心30 min，收集上清液；再向其加入硫酸銨至70%飽和度，4 ℃條件下鹽析3 h后，在4 ℃、12 000 r/min條件下離心30 min，收集沉淀；沉淀用含0.5 mol/L NaCl的0.02 mol/L Tris-Hcl 緩沖液（pH值為8.6）溶解后超濾，慮管通過離心力使有機酸等小分子通過，大分子蛋白截留得到粗酶液。

1.5.2.2 粗酶液對磷酸鈣的溶解作用 加入1%磷酸鈣到粗酶液中，測定溶磷量。

2 結果與分析

2.1 溶磷細菌分泌產生的有機酸的種類及其溶磷效果

2.1.1 有機酸標準品的高效液相色譜圖 7種有機酸的出峰時間分別是草酸5.201 min，酒石酸6.420 min，蘋果酸8510 min，丙酸10.486 min，乙酸11.301 min，檸檬酸 15.250 min，琥珀酸18.445 min（圖1）。

2.1.2 發酵液中有機酸的色譜圖 與標準樣品色譜圖的出峰時間進行比對后，發現不接菌空白樣品的色譜圖中只有草酸、酒石酸、蘋果酸和乙酸存在，且含量較少，未見丙酸、檸檬酸和琥珀酸。而接菌的樣品發酵液色譜圖中7種有機酸均存在，而且草酸的含量明顯增高（圖2、圖3）。

2.1.3 菌株產有機酸的質量濃度 分別將不同濃度的有機酸標準液進樣，以峰面積為縱坐標，以有機酸濃度作為橫坐標繪制標準曲線（表1），通過比對相應有機酸標準曲線得到該樣品產有機酸的濃度（表2）。

菌株P0417的發酵液中，不僅有機酸的種類增多，而且含量也增加。發酵液中有機酸的濃度最終可達420.59 mg/L，約是空白對照組的10倍，其中草酸和琥珀酸的增加量最多（表2）。

2.1.4 有機酸對磷酸鈣的溶解作用 在不接溶磷菌條件下，向培養基中加入同種濃度的7種有機酸混合液，得出7種有機酸混合液的溶磷量是493.89 μg/mL，而溶磷菌P0417的溶磷量為503.53 μg/mL（表3），說明溶磷菌的溶磷作用可能存在多種機制，而有機酸的螯合作用是溶磷菌P0417溶磷的主要途徑。

2.2 溶磷細菌分泌產生的磷酸酶活性及其溶磷效果

2.2.1 發酵液中磷酸酶活性的測定 在相同條件下同時測定120 h內發酵液中酸性磷酸酶活力的變化和堿性磷酸酶活力的變化，發現酸性磷酸酶活力隨時間變化而不斷變化，且在72 h時達到最高，達2 186 μmol/（L·h），堿性磷酸酶活性也隨時間變化，且在72 h時達到最高，為2 571 μmol/（L·h） 。此外，在以磷酸鈣為單一磷源的培養基中，堿性磷酸酶的活力明顯高于酸性磷酸酶的活力（圖4）。

2.2.2 發酵液中磷酸酶對磷酸鈣的溶解作用 提取溶磷細菌P0417代謝產生的磷酸酶粗酶液，加入一定量磷酸鈣反應后測其溶磷量為18.37 μg/mL。說明磷酸酶也會產生一定的溶磷效果，但這種作用不是溶磷菌產生溶磷作用的主要原因。

3 結論與討論

20世紀初，人們就開始研究土壤微生物與磷轉化之間的關系，利用土壤溶磷菌降解土壤中豐富的難溶性磷源具有廣闊的應用前景。目前，有關溶磷的研究多集中在菌株篩選及應用效果等方面，有關溶磷機制的研究仍比較薄弱，樊磊等認為微生物對土壤溶磷的機理涉及有機酸、質子和酶解等作用[15]。關于有機酸溶磷的觀點認為，在微生物代謝過程中分泌的各種小分子量有機酸能與復合磷酸鹽中的鈣、鐵和鋁螯合釋放出磷酸根形成穩定的可溶性復合物而被植物體吸收利用[16]。關于質子溶磷的觀點認為，微生物在代謝活動中產生大量的質子可以與磷酸鹽發生交換，使酸度提高，從而使磷礦粉溶解[17]。關于磷酸酶溶磷的觀點是指，溶磷微生物分泌的磷酸酶能夠溶解無機難溶磷[18]。也有研究報道有的菌株同時存在這幾種溶磷機制[19]。Narsian等認為溶磷的最主要原因是溶磷微生物能夠產生大量的有機酸及磷酸酶等[20]。

本試驗對溶磷微生物分泌的有機酸及產生的磷酸酶進行了研究。通過液相色譜對發酵液分析后得出該微生物產生了草酸、酒石酸、蘋果酸、丙酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸等多種有機酸，總濃度達420.59 mg/L，其中草酸和琥珀酸的分泌量最多。有機酸對Ca3（PO4）2的溶解量為493.89 μg/mL，而溶磷菌的溶磷量為503.53 μg/mL，說明該微生物的溶磷作用主要來源于有機酸的分泌，這與Agnihotri的研究結果[21]基本一致。這些酸一方面使培養液的pH值下降，另一方面還與Ca2+、Mg2+、Fe2+、Fe3+、Al3+等離子以多種形式結合，使難溶性磷釋放出來[22]。溶磷過程中磷酸酶的活力隨時間的變化先增強后減弱又增強，說明磷酸酶活力與溶磷量無關，Patgiri等的研究結果也表明高效溶磷菌株的溶磷量與磷酸酶的活力無關，而與蛋白質的分泌量有關[23]。提取發酵粗酶液進行溶磷效果分析時發現，微生物分泌的磷酸酶也具有一定的溶磷效果，但溶磷量只有18.37 μg/mL。因此，在溶磷菌的溶磷作用中，溶磷菌分泌的有機酸主要起溶磷作用。endprint

在細菌P0417代謝過程中，草酸和琥珀酸的濃度相對較高，但菌體溶磷作用是否與這2種酸的產生有關需要進行進一步研究。Deubel等指出，溶磷細菌分泌的有機酸種類和數量并不是一成不變的，隨著外界碳源的改變，培養液中有機酸種類和含量都會發生變化[24]，今后有必要在這方面開展深入研究。

參考文獻：

[1]伊 鋆. 高效解磷細菌的篩選及解磷機理的研究[D]. 大連：大連理工大學，2011.

[2]Chung H，Park M，Madhaiyan M，et al. Isolation and characterization of phosphate solubilizing bacteria from the rhizosphere of crop plants of Korea[J]. Soil Biology and Biochemistry，2005，37（10）：1970-1974.

[3]陳華癸撰. 土壤微生物學[M]. 北京：商務印書館，1950：225-228.

[4]金術超，杜春梅，平文祥，等. 解磷微生物的研究進展[J]. 微生物學雜志，2006，26（2）：73-78.

[5]趙小蓉，林啟美. 微生物解磷的研究進展[J]. 土壤肥料，2001（3）：7-11.

[6]何玉龍，周青平. 解磷微生物研究進展[J]. 青海畜牧獸醫雜志，2012，42（2）：36-38.

[7]張寶貴，李貴桐. 土壤生物在土壤磷有效化中的作用[J]. 土壤學報，1998，35（1）：104-111.

[8]馮月紅，姚 拓，龍瑞軍. 土壤解磷菌研究進展[J]. 草原與草坪，2003（1）：3-7.

[9]王莉晶，高曉蓉，孫嘉怡，等. 土壤解磷微生物作用機理及解磷菌肥對作物生長的影響[J]. 安徽農業科學，2008，36（14）：5948-5950，5958.

[10]虞偉斌，楊興明，沈其榮，等. K3解磷菌的解磷機理及其對緩沖容量的響應[J]. 植物營養與肥料學報，2010，16（2）：354-361.

[11]賀夢醒，高 毅，胡正雪，等. 解磷菌株B25的篩選、鑒定及其解磷能力[J]. 應用生態學報，2012，23（1）：235-239.

[12]鐘傳青. 解磷微生物溶解磷礦粉和土壤難溶磷的特性及其溶磷方式研究[D]. 南京：南京農業大學，2004.

[13]黃 毅，徐榕敏，江信紅，等. 黃鱔堿性磷酸酶的分離純化及其部分性質研究[J]. 水生生物學報，2005，29（3）：323-328.

[14]孫 芳，任美鳳，胡瑞斌，等. 韭菜酸性磷酸酶的分離純化及酶學性質[J]. 食品科學，2013，34（17）：187-191.

[15]Bopaiah B M. Occurrence of phosphate solubilizing microorganisms in the root region of arecanut palms[J]. Plantation Crops，1985，13（1）：60-62.

[16]Li X L，George E，Marschner H. Extention of the phosphorous depletion zone in a VA-myeorrhizal white clover in a calcareous soil[J]. Plant and Soil，1991，136：41-48.

[17]Illmer P，Schinner F. Solubilization of inorganic caleium phosphates-solubilization mechanisms[J]. Soil Biology and Biochemistry，1995，27（3）：257-263.

[18]范丙全. 北方石灰性土壤中青霉菌P8（Penicillium oxalicum）活化難溶磷的作用和機理研究[D]. 北京：中國農業科學院，2001.

[19]趙小蓉，林啟美，李保國. 微生物溶解磷礦粉能力與pH值及分泌有機酸的關系[J]. 微生物學雜志，2003，23（3）：5-7.

[20]Narsian V，Patel H H. Aspergillus aculeatus as a rock phosphate solubilizer[J]. Soil Biology and Biochemistry，2000，32（4）：559-565.

[21]Agnihotri V P. Solubilization of insoluble phosphates by soil fungi isolated from nursery seedbeds[J]. Canadian Journal of Microbiology，1970，16（9）：877-880.

[22]樊 磊，葉小梅，何加駿，等. 解磷微生物對土壤磷素作用的研究進展[J]. 江蘇農業科學，2008（5）：261-263.

[23]Patgiri I，Bezbarah B. Strain contributing to phosophorus mobilization in acid soils[J]. India Journal of Agricultural Sciences，1990，60（3）：197-200.

[24]Deubel A，Gransee A，Merbach W .Transformation of organic rhizodeposits by rizoplane bacteria and its influence on the availability of tertiary calcium phosphate[J]. Journal of Plant Nutrition and Soil Science，2000，163：387-392.邱 陽，苗作云，劉學芝. 貢湖壬子港藻體堆積下黑水團發生風險研究[J]. 江蘇農業科學，2015，43（10）：435-439.endprint