他克莫司對小鼠腸黏膜屏障功能的損傷作用及分子機制

他克莫司對小鼠腸黏膜屏障功能的損傷作用及分子機制

呂亞青1，曲林林1，江海濤1，黎介壽2

(1青島大學附屬醫院，山東青島266555；2南京軍區南京總醫院)

摘要：目的觀察他克莫司(FK506)對小鼠腸黏膜屏障功能的損傷作用，并探討其分子機制。方法將24只C57BL/6小鼠隨機分為高劑量組、低劑量組和對照組各8只，分別予FK506 5 mg/kg、FK506 1 mg/kg、生理鹽水灌胃。用藥30 d處死小鼠，收集腸黏膜組織標本，采用HE染色法觀察腸黏膜組織結構變化，透射電鏡下觀察腸黏膜上皮細胞緊密連接的超微結構改變，采用分光光度法測定血漿D-乳酸，氧電極法測定腸組織線粒體呼吸功能，高壓液相色譜法檢測腸黏膜上皮細胞線粒體三磷酸腺苷(ATP)酶活性。結果低、高劑量組小鼠體質量較對照組明顯減輕，高劑量組減輕更明顯(P均<0.05)；低、高劑量組小鼠腸上皮細胞間緊密連接超微結構遭到破壞，其損傷程度與FK506劑量呈正相關；與對照組比較，低、高劑量組小鼠血漿D-乳酸水平升高，高劑量組升高更明顯(P均<0.05)；與對照組比較，低、高劑量組小鼠小腸3態呼吸耗氧量、呼吸控制率、膜電位、ATP酶活性下降，4態呼吸耗氧量升高，高劑量組變化更明顯(P均<0.05)。結論 FK506能損傷小鼠腸黏膜屏障功能，且損傷程度呈劑量依賴性；其分子機制可能是通過損傷小鼠腸黏膜細胞線粒體功能而損傷腸黏膜屏障功能。

關鍵詞：腸黏膜屏障；他克莫司；線粒體；小鼠

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.45.004

中圖分類號：R333.3 文獻標志碼：A

基金項目：山東省優秀中青年科學家科研獎勵

作者簡介：第一呂亞青(1976-)，女，主管護師，主要研究方向為圍手術期腸屏障功能保護。E-mail:uuto2004@126.com

作者簡介：通信黎介壽(1923-)，男，中國工程院院士，醫學博士，主要研究方向為胃腸外科疾病的診治。E-mail:lijieshounju@126.com

收稿日期：(2015-08-01)

Damaging effect of FK506 on intestinal mucosal barrier function

in mice and its molecular mechanism

LYUYa-qing1, QU Lin-lin, JIANG Hai-tao, LI Jie-shou

(1TheAffiliatedHospitalofQingdaoUniversity,Qingdao266555,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the damaging effect of tacrolimus (FK506) on intestinal mucosal barrier function in mice and to investigate its possible molecular mechanisms. MethodsTwenty-four C57BL/6 mice were randomly divided into 3 groups (8 in each group): high-dose group (5 mg/kg), low-dose group (1 mg/kg) and the control group (normal saline). All mice were sacrificed after FK506 was administered for 30 days and the intestinal mucosal tissues were obtained. The structure of intestinal mucosa was observed by HE staining and ultrastructure was observed by transmission electron microscope. The level of D-lactate was detected by spectrophotometry. The function of mitochondrion was detected with Clark electrodes. The adenosine triphosphate (ATP) was detected with high pressure liquid chromatography. ResultsThe body weight of mice was decreased significantly in the high-dose and low-dose groups as compared with that of the control group, and the body weight lost more in the high-dose group than in the low-dose group (all P<0.05). The ultrastructure of intestinal mucosa was destroyed in high-dose and low-dose groups and it showed a dose-dependent manner. Compared with the control group, the level of D-lactate was increased significantly in the high-dose and low-dose groups and it was more significant in the high-dose group (all P<0.05). Compared with the control group, state Ⅲ oxygen consumption, respiratory control ratio, membrane potential and enzymatic activity of ATP were decreased significantly and state Ⅳ oxygen consumption was increased significantly in the high-dose and low-dose groups, and the changes were more significant in the high-dose group than in the low-dose group (all P<0.05). ConclusionFK506 could destroy the intestinal mucosal barrier function with a dose-dependent manner, and the molecular mechanism may be caused by destruction of the mitochondrion of intestinal mucosal cells.

Key words: intestinal mucosal barrier; tacrolimus; mitochondrion; mice

目前，對抗器官移植術后急性排斥反應主要應用免疫抑制劑[1]，其中他克莫司(FK506)作為一種強效免疫抑制劑被廣泛應用[2,3]，其通過抑制T輔助(Th)細胞釋放白細胞介素-2、抑制細胞毒T細胞增殖達到免疫抑制作用[4]。但FK506同時亦有較強的不良反應，特別是在大劑量使用時可發生難以控制的感染[5]，而感染是器官移植失敗甚至患者死亡的主要原因之一[6]。我們前期研究發現，FK506能造成小鼠腸黏膜屏障功能損傷，然而其具體機制仍不明確。2013年3～7月，我們觀察了FK506對小鼠腸黏膜屏障功能的損傷作用，并探討其分子機制。

1材料與方法

1.1 材料4周齡C57BL/6雄性小鼠24只(上海斯萊克實驗動物有限公司)，體質量16～19 g。FK506膠囊購自安斯泰來制藥(中國)有限公司。血漿D-乳酸檢測試劑盒購自杰美公司，ATP酶試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司。JEM-1200透射電鏡購自日本電子JEOL公司，氧電極購自英國Hansatech公司。

1.2造模及分組將24只小鼠隨機分為對照組、高劑量組、低劑量組，每組8只。將FK506完全溶于生理鹽水制成0.25、0.05 mg/mL溶液，高劑量組小鼠胃內灌注FK506 5 mg/kg，低劑量組胃內灌注FK506 1 mg/kg，每天連續給藥，7 d后隔天給藥至30 d。對照組每天胃內灌注相同容積的生理鹽水。用藥期間觀察小鼠的一般情況(體質量、有無腹瀉等)。于給藥30 d麻醉小鼠行腹正中切口取材，手術過程中腹腔內適量滴生理鹽水，保持組織活性。

1.3腸黏膜組織病理學觀察取回盲部靠近回腸部1 cm腸管，于等滲鹽水中洗凈腸內容物。組織標本用10%甲醛固定待行病理學檢查，采用HE染色，光鏡下觀察。

1.4腸黏膜上皮細胞緊密連接超微結構觀察取回盲部近結腸部約1 mm×1 mm×3 mm腸段，快速固定于3%的冷戊二醛溶液中2 h，1%鋨酸固定1 h，丙酮梯度脫水，環氧丙烷置換，Epon-812樹脂包埋，超薄切片機切片，醋酸鈾-檸檬酸鉛雙重電子染色，JEM-1200透射電鏡下觀察腸黏膜上皮細胞緊密連接的超微結構改變。

1.5血漿D-乳酸檢測于給藥30 d心臟穿刺取血1.5 mL，新鮮血液標本離心(400 g，10 min)后，采用分光光度法測定血漿D-乳酸。

1.6腸黏膜上皮細胞線粒體功能檢測給藥30 d后麻醉小鼠，行腹正中切口獲取小鼠回腸組織，用差速離心法分離小鼠回腸組織線粒體，按1 g組織∶9 mL分離介質的比例加入線粒體分離介質，組織剪碎后勻漿，低溫離心，洗滌沉淀2次。洗滌后線粒體沉淀加300 μL分離介質溶解制成線粒體混懸液。采用氧電極法測定線粒體呼吸功能。反應總體積800 μL，設置溫度為30 ℃。調節反應介質氧含量至高點并調節氧含量至0點，穩定后，向反應池中依次加入線粒體懸液100 μL，反應底物蘋果酸鈉(1.25 mol/L)10 μL和谷氨酸鈉(1.25 mol/L)10 μL，間隔約1 min后加入腺苷二磷酸(ADP)(40 mmol/L)5 μL，觀察線粒體呼吸態的變化。記錄氧耗曲線。計算在ADP加入后3態呼吸(ST3)和ADP耗盡后4態呼吸(ST4)的氧耗量。線粒體呼吸活性以消耗線粒體蛋白表示，呼吸控制率(RCR)以3、4態耗氧之比(ST3/ST4)表示。采用羅丹明123作為熒光探針測定線粒體膜電位，線粒體膜電位=59×log([羅丹明123濃度]線粒體內/[羅丹明123濃度]線粒體外)。

1.7腸黏膜上皮細胞線粒體腺苷三磷酸(ATP)酶活性檢測采用高壓液相色譜法。將差速離心法分離所得小鼠回腸組織線粒體懸液嚴格按ATP酶試劑盒說明書操作。定義每小時每毫克組織蛋白中ATP酶分解ATP產生1 μmol無機磷的量為1個ATP酶活力單位。

2結果

2.1實驗動物一般情況低、高劑量組小鼠體質量較對照組明顯減輕，給藥劑量越大體質量增加越緩慢。低劑量組、高劑量組小鼠出現不同程度的腹瀉癥狀。

2.2小腸黏膜組織病理學變化光鏡下可見低、高劑量組小鼠的小腸絨毛粗糙，腸黏膜與腸黏膜下層充血、水腫、糜爛，并伴有炎性細胞浸潤，低劑量組黏膜損傷程度輕于高劑量組。

2.3腸黏膜上皮細胞緊密連接超微結構改變透射電鏡下可見低劑量組小鼠腸黏膜上皮細胞間緊密連接間隙增寬，結構模糊；高劑量組小鼠腸黏膜緊密連接不僅出現間隙增寬、結構破壞，其橋粒結構亦消失。

2.4血漿D-乳酸水平變化對照組、低劑量、高劑量組小鼠血漿D-乳酸水平分別為(0.43±0.07)、(0.81±0.02)、(0.22±0.03)mmol/L，與對照組比較，低、高劑量組小鼠血漿D-乳酸水平升高，高劑量組升高更明顯(P均<0.05)。

2.5腸黏膜上皮細胞線粒體呼吸功能變化及ATP酶活性結果見表1。

表1　三組小鼠小腸線粒體呼吸功能比較 ± s)

注：與對照組相比，*P<0.05；與低劑量組相比，#P<0.05。

3討論

隨著免疫抑制劑的臨床應用,器官移植術后急性排斥反應得到了較好控制[7]，但移植術后的其他問題逐漸顯現出來。腸道是人體內最大的貯菌庫，在移植術后，因腸黏膜屏障功能受損導致的細菌移位可造成嚴重的菌血癥、毒血癥、敗血癥等，甚至導致多器官功能障礙綜合征，成為小腸移植手術失敗的主要原因之一[8]。

FK-506為一種新型強效免疫抑制劑，可致腸黏膜屏障功能損傷，但損傷的機制仍不明確。有研究認為，腸黏膜屏障功能的維持可能呈能量依賴性[9]。當細胞能量代謝發生障礙時主要表現為細胞內ATP水平下降，ATP是體內最重要的高能化合物，亦是各種生命活動能量的直接供應者。細胞內80%以上的ATP在線粒體合成，線粒體功能障礙將致ATP合成受阻，造成細胞內各種合成反應中斷、氧自由基生成增加及細胞膜穩定性受到破壞、細胞凋亡增加等嚴重后果[10]。而腸黏膜上皮細胞更新迅速，其對能量的供應變化極其敏感，當ATP生成障礙時，將造成腸黏膜上皮細胞的大量凋亡，腸黏膜屏障功能無法維持，腸黏膜通透性增加[11]。腸黏膜屏障的結構基礎是相鄰腸上皮細胞間的緊密連接，其封閉了相鄰腸黏膜細胞間的空隙，能阻止大分子物質由此通過，其構成與解離亦受到能量代謝的影響[12,13]。因此，FK-506導致的細胞能量代謝障礙將造成腸黏膜上皮細胞緊密連接發生破壞，表現為腸屏障功能受損。本研究結果顯示，應用FK-506后小鼠血漿D-乳酸水平明顯上升，提示腸黏膜通透性增加，同時可觀察到腸黏膜上皮緊密連接發生改變。

FK-506造成線粒體功能受損，導致能量生成障礙，其可能的作用機制：①線粒體氧化磷酸化脫偶聯。氧化磷酸化是與電子傳遞過程偶聯的磷酸化過程，是ADP被磷酸化生成ATP的酶促過程,亦是合成ATP的主要途徑。線粒體氧化磷酸脫偶聯后,磷酸化過程受阻,電子傳遞過程中將不能產生ATP。②增加線粒體中氧自由基的產生。氧自由基主要來源于線粒體呼吸鏈反應，細胞內90%以上的氧自由基由此產生。在正常情況下，電子通過呼吸鏈傳遞給O2生成H2O。當線粒體功能下降時，O2不能被有效利用，導致大量電子漏出，與O2反應生成氧自由基。氧自由基使生物膜中的多不飽和脂肪酸(PUFA)過氧化，導致生物膜中PUFA含量明顯減少，膜的液態性、流動性和通透性發生改變[14]。

本研究中我們觀察到FK506造成腸黏膜上皮細胞線粒體功能破壞，導致腸黏膜上皮細胞間緊密連接破壞，腸屏障功能受到損傷，且損傷程度呈劑量依賴性；其分子機制可能是通過損傷小鼠腸黏膜細胞線粒體功能而損傷腸黏膜屏障功能。

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