磁共振灌注成像評估瑞加德松開放血腦屏障的初步研究

常燦燦，周軍，楊本強，李虹易，徐志華，林森，段陽

（1.沈陽軍區總醫院放射科，遼寧沈陽110016；2.沈陽第四人民醫院放射科，遼寧沈陽110031）

磁共振灌注成像評估瑞加德松開放血腦屏障的初步研究

常燦燦1，周軍2，楊本強1，李虹易1，徐志華1，林森1，段陽1

（1.沈陽軍區總醫院放射科，遼寧沈陽110016；2.沈陽第四人民醫院放射科，遼寧沈陽110031）

目的：利用MR灌注成像（MR PWI）評價瑞加德松對兔腦血腦屏障的開放程度。方法：50只新西蘭大白兔隨機分為實驗組（A組）和對照組（B組），分別經耳緣靜脈注入瑞加德松和生理鹽水，延遲10 min后行MR PWI掃描。比較分析兩組感興趣區rCBF、rCBV、TTP及MTT參數值差異（配對t檢驗）。各組隨機選5只兔子，圖像采集后即刻靜脈注入2%伊文氏藍，1小時后處死取腦組織觀察藍染情況。結果：A組感興趣區rCBF、rCBV較B組明顯增高，腦組織藍染明顯，有統計學差異（P＜0.05），TTP值、MTT值在兩組間無明顯差異（P＞0.05）。結論：MR PWI的參數rCBF和rCBV可在體監測瑞加德松開放血腦屏障的程度。

血腦屏障；磁共振成像

中樞神經系統疾病的治療藥物不能很好的發揮治療作用的重要原因是由于血腦屏障（Blood-brain barrier，BBB）這一天然的生理屏障的存在[1]。因此，如何安全有效的開放BBB，提高藥物治療的療效成為近年來的研究熱點。瑞加德松是首個A2a腺苷受體激動劑，可通過激活A2a腺苷受體，促進冠脈舒張和增加冠脈血流量，在心肌灌注造影研究中顯示其應激安全、有效[2]。相關研究報道其具有短暫開放BBB的作用，但是評價其BBB開放程度的影像學研究尚未見報道。本研究旨在探討瑞加德松開放BBB的可行性，并通過磁共振灌注成像（MR perfusion weighted imaging，MR PWI）來進行在體評價和檢測，初步探討BBB開放的程度。

1 資料與方法

1.1 實驗動物及分組

成年健康家兔50只（動物實驗中心提供），不分雌雄，體質量（3～4 kg），隨機分為實驗組（A組）和對照組（B組），每組25只，分別經耳緣靜脈注入瑞加德松和生理鹽水，而后延遲10 min進行MR PWI掃描，實驗前兔子自由飲水。

1.2 藥物和材料

美國GE公司Discovery D750 3.0T MRI超導型磁共振；瑞加德松注射液5 mL（0.4 mg）；釓噴酸葡胺注射液（DTPA，0.4 mL/kg）；Sigma 2%伊文氏藍溶液；pH 7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS溶液）；二甲基亞砜。GE公司AW 4.6后處理工作站；Medrad公司的雙筒自動高壓注射器。國產24G×19mm靜脈留置針。

1.3 實驗動物準備

實驗前家兔8 h禁食，自由飲水，所有家兔均經腹腔注射4%水合氯醛（0.3 mL/100 g），觀察其達到滿意的麻醉狀態后，由耳緣靜脈放置24 G靜脈留置針并妥善固定。將家兔仰臥位固定于特制木板上后置于掃描床上，連接高壓注射器與靜脈留置針。術中根據情況適量追加麻醉劑及補充生理鹽水。

1.4 檢查方法

采用Discovery D750 3.0T MRI超導型磁共振成像系統和膝關節正交線圈，兔頭部置于線圈中心，以基底節區為中心冠狀位掃描，層厚3 mm，層間距1 mm。

采用平面回波自由衰減序列連續掃描50次，在采集第4次圖像后經耳緣靜脈快速團注0.3 mmol/kg的Gd-DTPA，注射流率1 mL/s，立即團注5 mL生理鹽水，2～4 s內完成注藥，每個掃描層面產生50幀連續的圖像，共650幅灌注圖像。PWI掃描參數為TR蛐TE=850蛐40 ms，FOV 12 cm，矩陣96×96，NEX：1，翻轉角90°，1 s蛐次，共50次，掃描時間1分25秒。

1.5 圖像后處理

MR PWI原始圖像轉到GE公司AW 4.6后處理工作站進行圖像后處理，采用Functool軟件據磁化敏感造影劑造成的每個像素信號下降的程度，計算出信號強度-時間曲線，進而構建出每層掃描圖像的灌注偽彩圖像，分別為相對局部腦血容量（rCBV）圖、相對局部腦血流量（rCBF）圖、平均通過時間（MTT）圖和對比劑峰值時間（TTP）圖。選取基底節層面，分別在基底節區、兔腦皮層區和對側相應區域選擇4個感興趣區（ROI，3～4 mm2），計算其rCBV、rCBF、MTT、TTP值，取平均值，A、B兩組進行比較。

1.6 伊文氏藍染色

A、B兩組各隨機抽取5只兔腦圖像采集后即刻靜脈注入2%伊文氏藍，循環1 h后左心室灌注處死取腦，進行腦組織冰凍切片，采用熒光顯微鏡觀察腦組織細胞熒光亮度及熒光物質的分布。

1.7 統計學分析

引用SPSS 17.0統計軟件進行分析，兩組數據之間比較采用t檢驗，P＜0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組兔腦冠狀面灌注偽彩圖像結果

實驗組rCBV、rCBF圖較對照組出現明顯的高灌注區，且主要分布于基底節區和血管走形區周圍。實驗組與對照組之間MTT圖、TTP圖未見明顯改變（圖1～6）。

2.2 兩組兔腦各灌注參數結果

對兩組兔腦感興趣區各參數進行配對t檢驗，實驗組rCBF、rCBV較對照組明顯增高，差異有統計學意義（P＜0.05)，而MTT值、TTP值則未見明顯差異，P＞0.05（表1）。

2.3 熒光顯微鏡觀察

實驗組兔腦感興趣區可見明亮的紅色熒光，神經細胞也可見鮮艷的紅色熒光，而對照組感興趣區未見確切的熒光（圖7）。

Table 1Comparison of MR cerebral perfusion parameter values of basal ganglia and cortex of rabbit brain in two groups

3 討論

BBB是存在于血液和腦組織之間的一種生物屏障系統，主要由毛細血管內皮細胞及其基膜、內皮之間形成的緊密連接、毛細血管周圍的神經膠質細胞等結構構成[3]。BBB通過內皮血細胞之間的緊密連接限制了大分子物質甚至許多小分子物質進入中樞神經系統內，從而對腦組織內環境的穩定起到重要作用[4]。正是由于BBB的存在，在病理狀態下，使許多治療藥物或診斷試劑也難以逾越BBB進入腦組織發揮治療作用[5]。因此，國內外學者致力于研究如何短暫、安全、可逆地增加BBB的通透性，使腦組織內藥物達到更大治療濃度，提高腦內疾病治療療效。已有的一些方法包括：經動脈灌注高滲性甘露醇溶液使腦微血管內皮細胞萎縮，細胞之間的間隙增大，BBB通透性增加[6-7]，但是這種高滲性開放BBB會引起癲癇發作，不能重復應用[7]，未取得好的臨床應用價值，只局限于動物實驗中；另外，直接向腦室內注入藥物來開放BBB的侵入性方法會對腦組織造成傷害[8-9]；治療性物質可以與一些因子連接，這些因子可以激活受體依賴性細胞內吞作用，但是BBB內吞作用能力有限，并且相關受體的表達需要充分[10]；利用化學物質攜帶載體，例如增加親油性但是需要增加藥物的大小從而限制了細胞通透的能力[11]。這些方法均不同程度對神經組織有害，可以造成腦組織損傷，因而難以實現臨床應用。

圖1 ～6基底節區冠狀面MR PWI參數圖。a圖為實驗組，b圖為對照組。圖1：兔腦MR T2WI冠狀面定位圖像。圖2：兔腦各個感興趣區的時間-信號變化曲線。圖3：兔腦腦血流量偽彩圖（rCBF圖）。圖4：兔腦腦血容量偽彩圖（rCBV圖）。圖5：兔腦平均通過時間（MTT圖）。圖6：兔腦對比劑峰值時間（TTP圖）。對照組感興趣區rCBV、rCBF、MTT、TTP圖像顯示對稱性灌注，未見異常灌注區，而實驗組相同感興趣區rCBV、rCBF呈散在分布高灌注，且高灌注區主要分布于血管走形區周圍。MTT、TTP圖未見明顯改變。Figure 1～6.Coronal MR PWI parameter images of basal ganglia region.Figure a represented experimental group,Figure b represented control group.Figure 1:The coronal-locating images of MR T2WI.Figure 2:The time-signal curves.Figure 3:The relative cerebral blood flow color map(rCBF).Figure 4:The relative cerebral blood volume color map(rCBV).Figure 5:The mean transit time color map(MTT).Figure 6:The time to peak color map(TTP).The color map of rCBV,rCBF,MTT,TTP of the ROI showed symmetrical and normal perfusion in control group,while there were diffused hyper infusion area in the same ROI which were distributed around the vessels.The color maps of MTT, TTP had no significant difference between two groups.

圖7 熒光顯微鏡觀察。圖7a：實驗組兔腦感興趣區可見明亮的紅色熒光，神經細胞也可見鮮艷的紅色熒光。圖7b：對照組感興趣區未見確切的熒光。Figure 7.Fluorescence microscope.Figure 7a:There was no positive fluorescence in the ROI of the control group.Figure 7b:There was bright red fluorescence in the ROI of the experimental group,meantime,in the nerve cell.

近年來，隨著分子生物學、免疫學及相關學科的發展，腺苷受體與BBB之間的關系取到了進一步認識。腺苷受體激活途徑代表了一種新型的、內源性調節BBB通透性的機制。瑞加德松作為一種新型的A2a受體激動劑，通過激活腦微血管內皮細胞A2a受體，可誘導肌動蛋白應力纖維形成，進而重構細胞骨架[12-13]，引起細胞形態發生改變，致使細胞間縫隙增寬、增多。Carman等[14]研究發現，BMEC之間緊密連接蛋白的表達在腺苷受體激活后的明顯下調，以Occludin的改變為著。另外這一過程中血管內皮單層細胞跨膜電阻會降低，這一系列的變化使BBB中腦微血管內皮細胞之間的間隙增大，處于松弛狀態，相當于血管容積和毛細血管血流量增大。而MRPWI正是用于反應組織微血管的血流灌注狀況的一種功能性成像方法[15]，因此，本研究試圖用MR PWI來評價瑞加德松注射液對兔腦BBB的開放。

本實驗結果顯示瑞加德松進入兔血液循環10min后，MR PWI顯示兔腦組織感興趣區的血流灌注參數發生改變，rCBF、rCBV值較空白對照組明顯升高，差異具有統計學意義，且rCBF圖、rCBV圖顯示出高灌注區。rCBV反映特定區域內毛細血管和大血管床容積，rCBF為單位時間內流經特定腦區域的血液容量，代表組織的毛細血管流量，且相關研究表明[16-18]在MR PWI評估膠質瘤分級中灌注參數rCBV和rCBF具有良好的相關性。本實驗結果二者明顯升高，差異具有統計學意義，說明瑞加德松進入血液循環后可能引起毛細血管和大血管床容積增大，毛細血管血流量增加，rCBF、rCBV值增大，BBB通透性增加，BBB開放。實驗組和對照組MTT值、TTP值之間無明顯差異，瑞加德松造成兔腦組織局部BBB毛細血管內皮細胞間隙增大，血管床容量升高，從rCBF、rCBV圖可以看出這種改變的范圍較散在分布，對血液的平均通過時間和對比劑達峰時間未見造成明顯影響，且在諸多關于腦膠質瘤腫瘤血管灌注成像評價中MTT值、TTP值由于血管的自動擴張導致很難準確測量[19]，因此MTT值、TTP值的價值有待深入探討。

同時，利用EB失蹤法顯示兔腦大體標本對照組腦組織未見明顯異常藍染，實驗組大腦表面不同程度藍染。經冰凍切片，在熒光顯微鏡下觀察，發現實驗組腦組織脈絡叢表面、嗅結節、紋狀體和聽神經核，其次是腦膜、大腦皮層和海馬區域被激發出明亮的紅色熒光，對照組相應區域無明顯的紅色熒光物質，從而證實瑞加德松對BBB的開放。

綜上所述，本實驗研究表明瑞加德松作為一種選擇性腺苷受體激動劑，通過激活BBB上內源性腺苷受體，可以引起BBB的開放，同時利用MR PWI的灌注參數的變化可以在體監測BBB的開放程度，為臨床上促進治療藥物跨越BBB進入腦組織提供一種在體定量無創檢測的影像學方法。

本實驗不足之處在于未對瑞加德松對BBB開放的時間窗行探討和分析總結，由于受到經費和設備的限制未能使用相應的小動物頭部線圈進行MR圖像采集。

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Preliminary study on assessment of regadenoson-induced blood-brain barrier
opening by MR perfusion weighted imaging

CHANG Can-can1,ZHOU Jun2,YANG Ben-qiang1,LI Hong-yi1,XU Zhi-hua1,LIN Sen1,DUAN Yang1
(1.Department of Radiology,the General Hospital of Shenyang Military Region,Shenyang 110016,China; 2.Department of Radiology,Shenyang the Fourth Hospital of People,Shenyang 110031,China)

Objective:To evaluate the level of regadenoson-induced blood-brain barrier opening of healthy rabbits via MR perfusion weighted imaging(MR PWI)scan.Methods:Fifty New Zealand white rabbits were randomly divided into experimental group(group A)and control group(group B).The regadenoson and normal saline were injected intravenously into ear margin separately,after 10 minute,MR PWI scan was performed.Then rCBF,rCBV,TTP and MTT of the region of interest of each group were acquired and compared statistically(paired t test).Five cases of each group choosed randomly were injected with 2%Evens blue intravenously posterior to imaging.After one hour of infusion,all the animals were killed.Their brains were examined for the determination of Evens blue distribution.Results:The rCBF and rCBV values and the staining with Evens blue of group A were significantly higher than those of group B(P＜0.05).There were no significant differences of TTP and MTT values between group A and B(P＞0.05).Conclusion:The parameters(rCBF,rCBV)of MR PWI scan can monitor the level of regadenoson-induced blood-brain barrier opening in vivo.

Blood-brain barrier;Magnetic resonance imaging

R338；R972；R445.2 [

]A [

]1008-1062（2016）10-0690-04

2016-01-07；

2016-03-07

常燦燦（1991-），女，安徽亳州人，醫師。E-mail：853348688@qq.com

段陽，沈陽軍區總醫院放射科，110016。E-mail：duanyang100@126.com

本文課題受遼寧省科技攻關基金項目（編號：2012225019）資助。