液相色譜串聯電化學檢測器測定人體血漿和尿液兒茶酚胺濃度

王玲　陽愿望

【摘要】目的：建立一種簡便、快速、靈敏、準確的測定人體血漿、尿中兒茶酚胺的方法，為臨床檢測和研究提供技術支持。方法：采用活性氧化鋁（AL₂O₃）對血漿和尿液標本中的兒荼酚胺進行酸解吸附、凈化，利用離子對反相高效液相色譜串聯電化學檢測器法（RP-HPLC-ECD）對其測定，工作電壓+0.80V，靈敏度50nA，以外標法定量。結果：去甲腎上腺素、腎上腺素、多巴胺分離良好，出峰時間分別為8分鐘、9分鐘、11分鐘，且不受體內其他內源性物質及代謝物干擾。樣本在2.0-100ng/ml濃度范圍內有良好線性關系，分離參數R≥1.5，其方法絕（相）對回收率分別為82.5-104.4%、83.4-100.7%、77.0-91.8%，最低檢測濃度1.0ng/ml。結論：RP-HPLC-ECD檢測人體血漿、尿中兒茶酚胺具有操作簡便，分析快速，特異性高，重復性好的優點。

【關鍵詞】兒茶酚胺；反相高效液相色譜；嗜鉻細胞瘤

單胺類神經遞質兒茶酚胺類（Catecholamines，CAs）化合物，主要包括去甲腎上腺素（NE）、腎上腺素（E）、多巴胺（DA）。它是人類中樞神經重要的信息傳遞物質，不僅直接參與植物神經功能的調控，還與許多功能型疾病有關。血漿和尿液中的CAs含量不但可作為嗜鉻細胞瘤的診斷依據，而且可應用于其他與兒茶酚胺有關疾病的研究，對研究這類神經遞質的生理功能及其代謝變化具有重要意義。傳統的熒光法與放射免疫測定法（Radio-immunassay，RIA），氣相色譜法（GC），或步驟繁瑣，或價格昂貴不易實現。由于電化學檢測器的高靈敏度，使該類化合物體內微量分析得以應用。本文建立的RP-HPLC-ECD測定人體血漿及尿中的兒茶酚胺，具有方法簡單，快速，專一，在應用中重復性較好，適用于臨床測定及研究人體內兒茶酚胺的代謝分析。

1儀器與材料

1.1儀器

美國Waters e2695型高效液相色譜系統、Waters2465電化學檢測器及Empower2色譜數據處理工作站。XW-80A旋渦混合儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司），DL-8M低速冷凍離心機（上海市離心機械研究所有限公司）。

兒茶酚胺（NE、E、DA）標準品（Sigma公司）；AL₂O₃、Tris進口分裝；甲醇、乙腈、冰乙酸、EDTA-Na2、B8（辛烷磺酸鈉）以上均為進口色譜純；濃鹽酸、無水NaAc為國產優級純或分析純試劑，試驗用水為娃哈哈596ml裝飲用純凈水。

2方法與結果

2.1標準溶液的配制

準確稱取NE、E、DA標準品用0.1mol/L HCL配制成1μg/ml的CAs混合標準溶液，分裝后置于-70℃冰箱長期保存。臨使用時用0.1mol/L HCL溶液稀釋成終濃度分別為100.0、50.0、20.0、5.0、2.0ng/ml五個濃度梯度。

2.2 Tris-HCL緩沖液的配制

稱取Tris 12.114 g用0.1mol/HCL溶解配制成1.OmoFl Tris-HCL緩沖液，調PH值至8.9。

2.3氧化鋁的活化

參照Anton等方法，稱100g氧化鋁于1000ml燒杯中，加2moFl HCL 500ml，90℃攪拌45min，冷卻，棄上清液及懸浮粒；加2mol/l HCL 250ml，70℃攪拌10mm，冷卻，棄上清液及懸浮粒，共兩次；加2mol/1 HCL 500ml，50℃攪拌10mm，冷卻，棄上清液及懸浮粒；反復用純水200ml/次，洗滌至PH≈3.4。將氧化鋁轉至蒸發皿，120℃烤1h，200℃烤2h，冷卻后在室溫下干燥貯存。每次做試驗前取部分氧化鋁200～C烤2h進行活化，冷卻至室溫，后稱活化的氧化鋁20mg/管至15ml塑料刻度試管中備用。

2.4色譜條件

分析柱，C18柱（Hypersil ODS2 5μm4.6*250mm，大連依利特科學儀器有限公司）。流動相：無水NaAc4.1g，EDTA-Na250mg，B8 80mg，冰乙酸7.5ml，乙腈80ml，加試驗用水至1000ml，調節PH值至4.2，0.22μm濾膜過濾后超聲脫氣。流速0.45ml/min；電化學檢測器工作電壓+0.80V，Ag/AgCL為參比電極，Range=50 nA，柱溫40℃。此條件下NE、E、DA分離良好，如圖1a，圖1b所示。

2.5樣品處理

2.5.1標本收集

血漿標本，宜在空腹臥床休息30min后抽取靜脈血，EDTA抗凝，4℃3500r/min，立即離心5分鐘，分離血漿后置-20℃凍存，檢測時室溫復融；尿液標本，在容器中以5-10ml濃鹽酸作防腐處理，收集24小時尿并記錄尿量，混勻，取10ml置-20℃凍存，檢測時室溫復融。

2.5.2樣品處理

在2.3項下已加入活化氧化鋁的15ml塑料刻度試管內加入0.4ml Tris-HCL緩沖液，取抗凝血，離心分離血漿1-2ml（離心后的尿液0.2ml），旋渦振蕩15min，使兒茶酚胺吸附在氧化鋁上，離心10min，棄上清液，沉淀用5ml試驗用水（預冷）洗滌4次，離心，小心用棉簽盡量吸干水相，沉淀加入0.2 mol/l的HCL 0.2 ml，旋渦振蕩15min，將吸附于氧化鋁上的兒茶酚胺解析下來，離心，取20lxl洗脫液用于進樣，根據外標法定量。

2.6結果

2.6.1標準曲線的制備

血漿：分別取空白血漿1.0ml及空白尿樣0.2ml置15ml塑料刻度試管內，將標準儲備液用0.1mol/HCL溶液稀釋成如“2.1標準溶液的配制”項下的標準工作液，混勻后照“2.5.2樣品處理”項下操作，進樣，以外標法峰面積對濃度進行線性回歸。CAs濃度在2.0-100ng/ml濃度范圍內線性良好，結果如表1示。

2.6.2精密度和重復性

取同一濃度標準品分多次在相同的試驗日和不同的試驗日測定，得方法重復性；按處理方法反復測定得日內變異系數（n=20）為1.44～2.48%，日問變異系數（n=20）為3.51～7.63%。結果如表2示。

2.6.3方法回收率

取空白血漿、尿液作基質，用配成的（低、中、高）三種濃度分別為5.0、10.0、50.0ng/ml的標準液分別加樣，按樣品處理方法處理測定，用實測濃度比加入濃度即得回收率。結果如表3所示。

3討論

（1）本實驗采用酸性活化氧化鋁萃取的方法進行生物樣品中的兒茶酚胺類化合物提取，活化效果滿意，回收率與文獻報道相近。

（2）色譜系統檢測條件設置多樣，其中色譜柱種類、柱效、流動相PH、離子對濃度、有機相比例等都是影響兒茶酚胺分離和定量的重要因素吲。本法取C18材料反相離子對色譜柱，流動相PH4.2，乙腈8%，分離和檢測效果良好。采用國產色譜柱大幅降低成本。

（3）本法樣品回收穩定，峰圖分離完全，檢測電化學反應呈良好線性關系和重現性，回收率分別為82.5-104.4%、83.4-100.7%、77.0-91.8%，回收率較高，精密度<8%，最低檢出限達40pg，全部峰圖在12分鐘內出齊，表明本法具良好特異性、穩定性和靈敏性，檢測速度也較寬，線性范圍（2.0-100ng/ml）較寬，能滿足臨床需求。

（4）對本實驗樣品的要求及固相萃取前處理時的一些注意事項：本實驗對血漿標本要求嚴格，抽取靜脈血后應立即在低溫條件下分離血漿并即時送檢，-20℃凍存待測，避免反復凍融。標本送檢不及時或未立即分離血漿對結果有較大影響，脂濁標本對氧化鋁萃取分離（導致回收率降低）和檢測結果均有影響。由于NE、E、DA有兩個鄰位酚羥基，極易被氧化，而且氧化劑、熱、光、堿都會加速其氧化分解，故有條件時應在避光及低溫條件下進行操作處理樣本。

（5）對制備好的實驗樣品的保存及降解情況作統計，證實樣品在48h之內無論4℃存放還是-70℃，其含量變化不大，72h后含量變化有統計意義。因此制備好的樣品在3d內檢測比較準確。