CDH1基因甲基化狀態與結直腸癌臨床病理特征及預后的相關性研究

方日，王小文

(湖南師范大學附屬湘南醫院中國人民解放軍第169醫院腫瘤科，湖南 衡陽 421002)

CDH1基因甲基化狀態與結直腸癌臨床病理特征及預后的相關性研究

方日，王小文

(湖南師范大學附屬湘南醫院中國人民解放軍第169醫院腫瘤科，湖南 衡陽 421002)

目的 探討CDH1基因啟動子所在5'-CpG島的異常甲基化與臨床病情發展、病理變化及術后預后的相關性。方法選取2013年1～12月在我院腫瘤科進行結直腸癌切除術的原發性結直腸癌患者184例，其中甲基化組86例，非甲基化組98例，所有入選患者由專人進行跟蹤隨訪。檢測CDH1基因啟動子所在5'-CpG島的異常甲基化，通過全基因組擴增技術對修飾后的DNA進行擴增，根據GenBank基因庫設計CDH1基因甲基化特異性引物及CDH1基因非甲基化特異性引物。結果甲基化組腫瘤直徑為(6.5±2.1)cm，大于非甲基化組的(3.2±2.2)cm，甲基化組腫瘤浸潤性所占比例54.7%，高于非甲基化組的42.9%，差異均有顯著統計學意義(P＜0.01)；甲基化組腫瘤分化程度(高分化14.0%，中分化36.0%)低于非甲基化組(高分化40.8%，中分化45.9%%)，差異有顯著統計學意義(P＜0.01)；甲基化組淋巴轉移率為67.4%、遠處轉移率為31.4%，高于非甲基化組的21.4%和17.3%，差異均有統計學意義(P＜0.05)；甲基化組臨床TNM分期更晚(甲基化組：Ⅰ期11.6%，Ⅱ期11.6%，Ⅲ期37.2%，Ⅳ期39.5%；非甲基化組：Ⅰ期27.6%，Ⅱ期32.7%，Ⅲ期20.4%，Ⅳ期19.4%)，差異均有顯著統計學意義(P＜0.01)；非甲基化組患者生存率(89.5%)高于甲基化組患者(68.7%)，差異有統計學意義(P＜0.05)。Cox比例風險模型結果顯示，腹腔灌洗液懸浮細胞CDH1基因甲基化是原發性結直腸癌患者術后預后生存率的獨立危險因素(RR=28.5，P＜0.01)。結論原發性結直腸癌患者腹腔灌洗液懸浮細胞CDH1基因甲基化程度提高，惡性程度高，預后差。

結直腸癌；CDH1基因；甲基化；腹腔灌洗液；預后

基因CDH1是一種依賴鈣離子的細胞粘附分子，編碼上皮性鈣黏蛋白(E-cadherin)，定位于染色體16q22.1的，對同種細胞細胞間的粘附有重要作用，它功能缺失與腫瘤的發生發展有著極為密切的相關性[1-2]。有研究報道，消化道腫瘤患者腫瘤組織中可檢測到CDH1的缺失、上皮性鈣黏蛋白的缺失或其表達水平的降低[3]。在其他常見腫瘤如卵巢腫瘤、頭頸部腫瘤中也有不同程度的確實或表達水平降低[2，4]。位于5'-CpG島的CDH1基因啟動子，其異常甲基化可影響上皮性鈣黏蛋白表達，進一步影響腫瘤的發生發展[5]。本研究選用實時熒光PCR技術，檢測甲基化特異性，獲取入選結直腸癌患者術中腹腔灌洗液，制備細胞懸浮液，檢測CDH1基因啟動子所在5'-CpG島的異常甲基化，同時對其異常甲基化與臨床病情發展、病理變化及術后預后的相關性進行探討。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年1～12月在我院腫瘤科進行結直腸癌切除術的原發性結直腸癌患者184例，所有入選患者由專人進行跟蹤隨訪，隨訪頻率根據患者自身情況決定，隨訪截止日期2014年12月31日。本研究由我院醫學倫理委員會批準通過并進行監督，所有患者及家屬對本研究內容及風險均表示知情并理解，并簽署知情同意書。納入標準：結腸鏡檢診斷為原發性結直腸癌；鏡檢獲取活組織病理切片確認為原發性結直腸癌；手術切除前未進行任何放化療等輔助治療；影像學CT及MRI判定為可切除腫瘤。排除標準：心臟超聲、血生化、肺通氣等檢查顯示患者身體情況無法接受手術者結直腸癌腫瘤位于腹膜反折下者。

1.2 DNA提取及亞硫酸鹽修飾方法 患者麻醉后，在開腹后、手術前溫熱生理鹽水500 mL灌洗腹腔，收集灌洗液，以備檢查。腹腔灌洗液細胞懸浮，提取懸浮細胞DNA，測定DNA濃度及純度，操作嚴格按照步驟進行。使用亞硫酸鹽轉化試劑盒對提取的DNA進行亞硫酸鹽修飾。亞硫酸亞轉化試劑盒操作步驟如下：10 μg提取DNA加入5 μL濃度為3 mol/L的NaOH裂解液。37℃20 min變性。加入濃度為2 mol/L的NaHSO4溶液520 μL，所用NaHSO4溶液濃度為2 mol/L。加入濃度為0.2 mol/L氫醌溶液30 μL。50℃16～18 h水浴。DNA樣品、8%異丙醇2 mL加入DNA純化樹脂1 mL進行濾析。加入3 mol/L醋酸鈉、無水乙醇進行沉淀。離心，棄上清。自然干燥。加入TE溶液20 μL溶解。使用全基因組擴增技術對修飾后的DNA進行擴增。-20℃保存備用。

1.3 DNA甲基化檢測方法 根據GenBank基因庫設計CDH1基因甲基化特異性引物及CDH1基因非甲基化特異性引物。其中CDH1基因甲基化特異性引物正義鏈為5'-TTAGGTTAGAGGGTTATCGCGT-3'，反義鏈為5'-TAATTTAGGTTAGAGGGTTATTGT-3'，擴增片段116 bp。CDH1基因非甲基化特異性引物正義鏈為5'-TAACTAAAAATTCACCTACCGAC-3'，反義鏈為5'-CACMCCAATCAACAACACA-3'，擴增片段97 bp?？瞻讓φ帐褂谜麴s水代替。陽性對照使用體外Sssl甲基轉移酶處理的人基因組全DNA。陰性對照組使用體外未經處理的人基因組全DNA。檢測使用ABI7500 PCR儀進行檢測，加入甲基化引物、非甲基化引物、各對照組樣本、各檢測組樣本進行實時熒光PCR檢測甲基化特異性。

1.4 甲基化的標準 根據測得CT值繪制標準曲線，計算各組甲基化DNA拷貝數，計算甲基化比率，計算公式為甲基化百分數=[甲基化DNA拷貝數/(甲基化DNA拷貝數+非甲基化DNA拷貝數)]×100%。所得甲基化百分數小于等于20%認為非甲基化，大于20%認為甲基化。將PCR所得產物使用2.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，紫外凝膠成像觀察所得條帶，出現甲基化條帶認為甲基化，出現非甲基化條帶認為非甲基化。綜合上述結果，將樣本及產物分為 甲基化組和非甲基化組。

1.5 統計學方法 應用SPSS19.0統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差(±s)表示，組間比較采用t檢驗，計數資料組間比較采用χ2檢驗。繪制生存曲線計算生存率。利用Cox比例風險模型進行多因素生存分析，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床病理比較 本組184例，其中男性109例，女性75例；年齡33～69歲，平均(48.2±9.6)歲。腹腔灌洗液懸浮細胞甲基化檢測結果顯示，甲基化組86例，非甲基化組98例。對兩組患者臨床病理結果檢查可知甲基化組腫瘤直徑大于非甲基化組(P＜0.01)，甲基化組腫瘤浸潤性所占比例高于非甲基化組(P＜0.01)，甲基化組腫瘤分化程度低于非甲基化組(P＜ 0.001)，甲基化組淋巴結轉移率、遠處轉移率高于非甲基化組(P＜0.05)，甲基化組臨床TNM分期更晚(P＜0.01)，見表1、表2和表3。

2.2 預后比較 對所有患者進行專人隨訪，隨訪時間為12～24個月。隨訪結果顯示，非甲基化組患者生存率(89.5%)高于甲基化組患者的生存率(68.7%) (P＜0.05)，見圖1。Cox比例風險模型結果顯示，患者腹腔灌洗液懸浮細胞CDH1基因甲基化是原發性結直腸癌患者術后預后生存率的獨立危險因素，RR=28.5 (P＜0.01)。

表1 兩組患者的臨床病理比較(±s)

表1 兩組患者的臨床病理比較(±s)

組別 性別(例)年齡(歲)腫瘤直徑(cm)淋巴結轉移[例(%)]遠處轉移[例(%)]女甲基化組(n=86)非甲基化組(n=98) t/χ2值P值男52 57 34 41 0.101 0.751 47.2±6.5 47.9±5.8 0.772 0.441 6.5±2.1 3.2±2.2 10.369＜0.01 58(67.4) 21(21.4) 39.582＜0.01 27(31.4) 17(17.3) 4.968 0.026

表2 兩組患者的腫瘤部位及大體類型比較[例（%）]

表3 兩組患者腫的瘤分化類型及TNM分期對比[例（%）]

圖1 患者生存曲線比較

3 討 論

消化道腫瘤的發病率、死亡率隨著我們社會進步、經濟發展、飲食改變逐年增加，成為臨床上極為常見的腫瘤之一[6]。作為一個在眾多抑癌基因中研究較為透徹的CDH1，它的缺失或結構改變與腫瘤的發生發展有著密切的聯系[7]?；駽DH1是一種依賴鈣離子的細胞黏附分子，編碼上皮性鈣黏蛋白，定位于染色體16q22.1的，對同種細胞細胞間的黏附有重要作用，對細胞的分化也有著促進作用[8]。CDH1在細胞分化維持、細胞極性維持、細胞組織結構維持等方面起著重要作用[9]。有研究報道，消化道腫瘤患者腫瘤組織中可檢測到CDH1的缺失、上皮性鈣黏蛋白的缺失或其表達水平的降低[10]。研究發現，CDH1表達缺失或表達水平降低是導致消化道腫瘤發生發展的重要因素[11]。有文獻報道，CDH1基因表達下降的原因可能是其基因突變或上游啟動子甲基化[12]。近期有研究報道稱，DNA上游啟動子甲基化較其基因突變在腫瘤的發生發展中更為常見。在腫瘤發生發展進程中，基因表達降低的重要機理之一就是啟動子區CpG島的甲基化[13]。因此，對DNA甲基化、甲基化與腫瘤發生發展的相關性、甲基化與腫瘤相關基因的研究逐漸受到重視。

Katarzyna等[14]研究結果顯示，所納入研究的35例原發性結直腸癌患者中CDH1基因啟動子區域CpG島甲基化檢出率為48%，同時研究發現原發性結直腸癌患者上皮性鈣黏蛋白水平的降低與CDH1基因啟動子區域甲基化有著顯著的相關關系。本研究結果表明，納入標準的184例原發性結直腸癌患者中，CDH1基因啟動子區域CpG島甲基化檢出率為46.7%。

基因的甲基化產生的影響包括腫瘤組織的發生發展、腫瘤細胞脫落、患者術后及其他輔助治療后預后等多方面[15]?；蚣谆梢詫е逻h處組織如腹腔內腫瘤細胞脫落，作為腹腔種植轉移的重要種子細胞。Yakirevich等[16]研究發現，腹腔灌洗液中無基因甲基化患者術后生存率高于、復發率低于發現基因甲基化患者。Benusiglio等[17]研究結果顯示，腹腔灌洗液中發現甲基化基因患者術后腹腔轉移率明顯高于無甲基化患者，此外，部分患者發現出現腫瘤的肝肺轉移。本研究結果表明，甲基化組患者淋巴轉移率、遠處轉移率高于非甲基化組患者。隨訪結果進行生存分析顯示，非甲基化組患者生存率高于甲基化組患者。Cox比例風險模型結果顯示，患者腹腔灌洗液懸浮細胞CDH1基因甲基化是原發性結直腸癌患者術后預后生存率的獨立危險因素。此結果與大多數文獻報道結果一致。

綜上所述，腹腔灌洗液懸浮細胞甲基化組患者較非甲基化組患者腫瘤直徑大，腫瘤浸潤性所占比例高，腫瘤分化程度低，淋巴轉移率、遠處轉移率高，臨床TNM分期晚。隨訪結果顯示，非甲基化組患者生存率高。Cox比例風險模型結果顯示，患者腹腔灌洗液懸浮細胞CDH1基因甲基化是原發性結直腸癌患者術后預后生存率的獨立危險因素。

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Correlation between CDH1 gene methylation status and clinical pathological characteristics and prognosis of colorectal cancer.

FANG Ri,WANG Xiao-wen.Department of Oncology,the 169thHospital of People's Liberation Army, Xiangnan Hospital Affiliated to Hunan Normal University,Hengyang 421002,Hunan,CHINA

ObjectiveTo investigate the correlation between the abnormal methylation of 5'-CpG islands harboring cadherin 1(CDH1)gene promoter in and the development of clinical condition,pathological changes and postoperative prognosis.MethodsA total of 184 patients with colorectal cancer resection of primary colorectal cancer in Department of Oncology in our hospital were selected and divided into methylation group(n=86)and non-methylation group(n=98)from January to December 2013.All patients were selected and followed up by specially-assigned person. The abnormal methylation of 5'-CpG islands harboring cadherin 1(CDH1)gene promoter was detected,and modified DNA genome was amplified by whole genome amplification technology.CDH1 gene methylation specific primers and CDH1 gene non-methylation specific primers were designed according to GenBank.ResultsThe diameter of methylation group was significantly larger than that of non-methylation group[(6.5±2.1)cm vs(3.2±2.2)cm],and the proportionof tumor invasion was significantly higher than that of non-methylation group(54.7%vs 42.9%),with statistically significant difference(P＜0.01).Tumor differentiation degree in methylation group(high differentiation 14.0%,medium differentiation 36.0%)was significantly lower than that in the non-methylation group(high differentiation 40.8%,medium differentiation 45.9%),with statistically significant difference(P＜0.01).The rate of lymph node metastasis and the distant metastasis of methylation group were significantly higher than those of the non-methylation group(67.4%vs 21.4%, 31.4%vs 17.3%,P＜0.05).The clinical TNM staging was later in methylation group than non-methylation group(methylation group:11.6%in stageⅠ,11.6%in stageⅡ,37.2%in stageⅢ,39.5%in stageⅣ;non-methylation group:27.6% in stageⅠ,32.7%in stageⅡ,20.4%in stageⅢ,19.4%in stageⅣ),the differences were statistically significant(P＜0.01).The survival rate of patients in non-methylation group was significantly higher than those in methylation group (89.5%vs 68.7%,P＜0.01).Cox proportional hazard model results showed that CDH1 gene methylation of suspension cells in intraoperative abdominal lavage was an independent risk factor for prognosis in patients with primary colorectal cancer(RR=28.5,P＜0.001).ConclusionColorectal cancer patients with higher aberrant methylation of 5'-CpG of CDH1 gene promoter of suspension cells in abdominal lavage have higher malignancy,more metastasis and worse prognosis.

Colorectal cancer;Cadherin 1(CDH1)gene;Methylation;Peritoneal lavage;Prognosis

R735

A

1003—6350(2016)11—1779—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.11.019

2015-12-16)

方日。E-mail：fr5115@163.com