組織細胞pH值測量方法研究進展

吳佩琪　梁長虹*

分子成像

組織細胞pH值測量方法研究進展

吳佩琪1，2梁長虹2*

組織細胞中的氫離子濃度是機體的一個重要體液參數，與組織細胞的功能密切相關。因此，準確測定組織細胞內外的pH值，對反映組織細胞的功能狀態十分重要，對疾病的早期診斷和治療意義重大。常用的幾種可測定組織細胞pH值的方法包括MRI法、微電極法和熒光光譜法，就各種方法的原理及其優缺點進行分析，同時介紹其研究和應用進展情況，旨在為相關的實驗研究提供一定的參考。

pH值測量；磁共振波譜；化學交換飽和轉移技術；酰胺質子轉移技術；微電極；熒光光譜

Int J Med Radiol，2016，39（4）：410-415

病理狀態下，組織細胞內外常發生酸堿失衡，因此監測病變部位的pH值的大小和變化趨勢可一定程度上揭示組織細胞的生理和病理情況，為疾病的早期診斷及治療提供重要的信息［1］。正常組織細胞和病變組織細胞之間在藥物吸收、釋放、分布、代謝等方面都可能存在很大差異，準確、客觀地揭示這種差異對設計靶向藥物和個性化藥物治療方案非常有利［2］。如何進行細胞內外pH值的準確測定，尤其活體測定是研究的熱點。

1　組織細胞pH值及其臨床意義

氫離子濃度是指溶液中氫離子總數和總物質的量的比［3］。Sorensen于1909年提出，以氫離子濃度的常用對數的負值代替氫離子濃度來作為溶液酸堿度的簡明指標，定義為氫離子濃度指數（potential of hydrogen，pH），由公式pH=-lg［H+］計算。生物體內含有大量液體稱體液，pH值是一個重要的體液參數。細胞是生物體基本的結構和功能單位，機體的正常生理代謝有賴于細胞內外的酸堿平衡。研究表明，細胞內多種生命活動都受pH值的影響，例如細胞內酶活性的調節［4］、細胞生長與分化和細胞凋亡［5］等，而某些疾?。ㄈ缒[瘤、肺?。┑陌l生則可能與細胞質或者酸性細胞器（如溶酶體、內涵體等）內的pH異常有關［6］。

因此，如果可以通過某些方法記錄細胞內外pH值的瞬時和/或連續變化，則可間接推測細胞的功能活動，對了解細胞處于正常功能和病理狀態下的變化具有重要意義。目前臨床上血氣分析和尿檢等方法可提供人體內環境的酸堿信息，但這些方法主要是從宏觀判斷機體酸堿平衡狀況，而對于局部器官、組織及特殊部位（如大腦）的pH值變化，這些方法則無能為力。因此，研究可對細胞內外pH值進行準確測定的方法，尤其是可在活體情況下進行測定的方法，也就成為國內外研究者的研究熱點，具有重要的臨床意義。

2　MRI測定組織細胞pH值

MRI是目前唯一一種可無創地測定在體組織細胞pH值的方法，應用前景廣闊。它主要包括磁共振波譜法（magnetic resonance spectroscopy，MRS）、化學交換飽和轉移法 （chemical exchange saturation transfer，CEST）和酰胺質子轉移法 （amide proton transfer，APT）。

2.1MRS是一種利用核磁共振現象和化學位移作用進行特定原子核及其化合物定量分析的方法［7］。

2.1.1原理位于外加磁場中的人體組織內的原子核，其共振頻率不僅取決于外加磁場強度及其本身的物理性質，同時還受原子核在化合物中的化學環境的影響，同一種原子核（如H核）所在的化合物的化學環境不同則進動頻率就不同，產生的磁共振頻率也就不同，在頻譜上產生的共振峰也就有差別，這種現象就是所謂的化學位移［8］，即相同質子在MRS中吸收信號位置不同。MRS可以利用化學位移的不同，使不同化合物可以根據其在頻譜上共振峰的不同加以區別，由于共振峰的面積與共振核的數目成正比，從而能夠反映化合物的濃度變化。

目前MRS法測定組織細胞pH值時，使用的探針包括31P、19F和1H探針。19F具有較好的化學位移分散，因此關于pH敏感19F化合物的研究也得到了較大的發展［9］，但由于氟化物穩定性較差且常常具有毒性，因此目前仍多用于離體實驗或動物實驗［10］。1H-MRS是最早應用于臨床的MRS，在應用于臨床方面有其獨特優勢，Cerdan Ballesteros首先采用咪唑乙氧羰基丙酸作為pH敏感的1H探針，這種外源性1H探針無毒、非滲透，較19F化合物安全，但該法空間分辨力較低，敏感性也有待提高［11］。19F和1H探針在測定組織細胞pH值方面的應用遠不及31P探針，就31P-MRS在測定組織細胞pH值中的應用加以介紹。

31P-MRS是最早被發現可用于測定組織細胞內pH值（intracellular pH，pHi）的探針，其基本原理為：在施加外加磁場后，細胞內的無機磷庫中31P的頻譜發生依賴于pH值變化的化學位移，根據代謝物的MR波譜中無機磷和磷酸肌酸的位置可以計算出兩者的化學位移差，參考標準曲線，即可計算出該體素的pH值［12］。

2.1.2優缺點

2.1.2.1優點①具有無創性，對細胞結構無損傷、對細胞代謝功能無影響，避免了損傷導致的pH值改變，可用于活體實驗。②測量精確度較高，可精確到0.06個pH單位［13］。③可重復性好，儀器可重復用于在體組織細胞的pH值測定。④操作較為簡便，設定好MR設備的序列參數即可開始測量。⑤可同時獲得細胞內其他多種含磷化合物 （ATP、磷酸肌酸等）的信息，還可檢測細胞內糖酵解途徑的活性和細胞能態等方面的信息［7］。

2.1.2.2缺點①時間分辨力較低，實驗室必須注意維持組織細胞長時間穩定的生理狀態，方可測得較為準確的組織細胞pH值［14］。②空間分辨力較低，由于該法的細胞敏感性低，需要較高的細胞濃度，對單細胞pH值的測定困難；并且當細胞內pH值偏堿性時，會對測定結果的準確性產生較大影響，因此該法更適合研究細胞群體或部分器官或組織的pH值［15］。③MR設備體積龐大，須特定條件方能安裝設備，不太適合普通實驗室的常規使用。

2.1.3研究進展MRS不僅可以測定組織細胞pH值，還有助于理解能量代謝、代謝的調控及疾病對能量代謝的影響方式［7］。對于人體中能量代謝十分旺盛的細胞，如骨骼肌細胞等，MRS的無創、可同時檢測多種代謝產物的優勢極為顯著。Schmid等［16］在7 T MRI上對正常人運動過程中腓腸肌細胞的pH值以及氧化磷酸化相關物質和進行了測量，得出了兩者的相關關系曲線，為可能導致骨骼肌代謝受損的疾病如糖尿病和周圍性血管疾病等的影像診斷提供了參考依據。MRS對組織的pH測量可為發現缺血、腫瘤病灶提供參考，Matsuo等［17］利用該法對腫瘤的放化療療效進行評價，并認為該法是一種理想的無創性影像方法，對腫瘤組織內pH值、pO2在治療前后的變化等的測量結果較為精確，應用前景廣闊。31P-MRS已逐漸由化學和生物學領域向動物實驗、臨床活體生理及病理狀態下物質代謝和能量反應研究階段邁進，已成為臨床影像醫學研究的重要方法。

2.2CEST法CEST成像技術是一種對pH值變化敏感的新型MRI技術，是常規磁化轉移（magnetic transfer，MT）成像技術的一種，主要通過采集氫原子信號成像。

2.2.1原理人體多數組織中自由水與結合水以一定的比例存在，并不斷交換，而自由水與結合水的磁化性質不同，這種轉化稱MT?；瘜W交換在分子世界中普遍存在，如化學鍵的旋轉、構象的轉換和氫交換等。小分子溶液的磁化轉移現象時觀察到靠近水的共振頻率Z譜的不對稱性，并將之命名為CEST［18］。

根據所處化學環境的不同將組織中的氫質子分為3種：一是可移動的自由水中的質子（又稱自由池）；二是與蛋白質等大分子結合的、受到束縛的質子（又稱結合池）；三是內源性或外源性的某些游離大分子（如胺基、酰胺基等）上的質子（又稱特定分子池）。這3類氫質子由于其所處化學環境的不同，導致它們雖然處于同一主磁場中，但各自擁有不同的進動頻率。CEST主要研究的是特定分子池與自由池的化學交換效應。在MR設備中施加一個選擇性偏置射頻脈沖，選擇性地飽和某個特殊共振頻率的氫質子信號（即某種特定大分子），在適當的環境下（適宜溫度、pH范圍），這些特定分子池中的氫質子會和周圍自由水中的氫質子發生化學交換，進而將部分飽和轉移到自由水中的氫質子上，通過采集水信號即可體現出CEST效應的強弱。質子的化學交換速率與質子周圍的環境（溫度、pH值）密切相關，進行相應的運算即可得出pH值，最終獲得組織pH值的高分辨空間和/或時間分布圖。

2.2.2優缺點

2.2.2.1優點①無創性?？刹皇褂猛庠葱詫Ρ葎?，避免了對比劑帶來的各種不良反應，可自然地反映組織本征的生理或病理信息，從而用于活體實驗。②空間分辨力良好，可提供高分辨力的組織細胞pH值空間分布信息。③敏感性及特異性非常高，多種分子探針可進行特定生理或病理組織成像，濃度可達納摩爾級別［20］。④可獲得細胞內、外的pH值，測定細胞內pH值主要依賴酰胺質子轉移成像技術，而對細胞外pH值的測定則需要注入CEST成像對比劑［19］。⑤操作較為簡便。設定好MR設備的序列參數即可開始測量，并且預飽和射頻脈沖可以根據需要隨時開關，不對其他成像序列產生影響。⑥可重復性好。儀器可重復使用，且組織細胞不受侵害。

2.2.2.2缺點①時間分辨力較低。實驗室必須注意維持組織細胞長時間穩定的生理狀態，方可測得較為準確的組織細胞pH值。②對單細胞pH值的測定困難。由于該法的細胞敏感性低，需要較高的細胞濃度，并且當細胞內pH值偏堿性時會對測定結果的準確性產生較大影響，因此該法更適合研究細胞群體或部分器官或組織的pH值［20］。③MR設備安裝和使用受條件限制。④對比劑安全性問題。進行細胞外pH成像時須引用外源性對比劑，而后者大部分含有斕族元素［21］，其安全性尚未完全得到驗證，故一般不能用于活體研究。

2.2.3研究進展作為一種較新的MRI技術，研究者們仍在不斷實驗，力圖使該法的測量更為準確，更適于臨床應用。Liu等［22］設計的新的高通量MR方法，大大減輕了磁化率所受的影響，提高了細胞內外pH值測量的準確性。不僅可進行pH成像，還可以進行代謝物（如多糖、多肽等）成像［23］。因腫瘤灶內常常有細胞缺血壞死，并且腫瘤細胞的代謝與正常細胞不同，pH值也有所不同，因此該法對腫瘤早期檢出有重要意義。而這一進展主要得益于CEST對比劑的開發和應用，早期使用小分子（如糖類、氨基酸類等）合成的CEST，稱反磁性CEST對比劑，后發展為使用鑭族元素合成的CEST對比劑，稱順磁性CEST對比劑［24-25］。這也為腦卒中的診斷和治療效果評價等提供了一種新的診斷技術［26］。獲得pH值的絕對定量信息，尤其是獲取腦部pH定量CEST圖，是該技術的發展趨勢，這將促使該技術更廣泛地應用于臨床。

2.3APT法APT成像技術是CEST成像技術的一個分支。

2.3.1原理人體內的蛋白質含有各種特殊基團，如羥基、胺基、亞胺基、酰胺基等，在CEST成像中，如果選擇游離蛋白質及多肽鏈上的酰胺質子作為選擇性偏置射頻脈沖的飽和目標時，此時便可稱為APT成像技術。受到射頻脈沖飽和的酰胺質子與水中的氫質子不斷進行化學交換，水中氫質子部分飽和，導致水成像信號下降，通過采集自由水飽和前與飽和后信號的改變，間接獲得酰胺質子的交換速率，進而計算可得出pH值，最終獲得組織pH值的高分辨空間（及/或時間）分布圖。

2.3.2優缺點由于APT成像技術是CEST成像技術的一個分支，其優缺點與CEST法類似，故簡要描述。

2.3.2.1優點①可無創性對組織的生理環境進行評估，可用于活體實驗。②空間分辨力良好。③敏感性及特異性較高。④可獲得高分辨力的活體蛋白質和多肽的濃度等信息，更加符合臨床診斷的需要［28］。⑤操作較為簡便。⑥可重復性好。⑦一般不引入外源性對比劑，無對比劑安全性的擔憂。

2.3.2.2缺點①時間分辨力較低。②對單細胞pH值的測定困難。③不太適合普通實驗室的常規使用。

2.3.3研究進展APT法作為一種可安全應用于人體的理想手段，并且可探測某些組織細胞內蛋白質含量的變化，其在臨床上的研究和應用日益廣泛。目前，該法已廣泛地應用于對腦卒中的研究［29］，并且，Harston等［30］的研究認為，相較于普通的T1、T2加權影像以及DWI，APT成像對缺血半暗帶的敏感性更高，可作為缺血半暗帶的代謝標記圖。該法也逐漸開始應用于阿爾茨海默病的研究，Wang等［31］研究發現，阿爾茨海默病病人的雙側海馬區磁化轉移率（在3.5ppm處，ppm表示10-6）的不對稱性明顯高于正常人，提示APT成像極有可能成為該病的具有生物影像標記意義的無創性影像檢查方法?？傊?，APT成像技術是一種臨床應用前景十分廣闊的pH測量技術。

3　其他方法

3.1微電極法微電極是指電極尖端長為幾微米至幾百微米且直徑在0.25～5.00 μm范圍內的電極，但用于細胞外測定時，尖端直徑為幾百微米者也可叫作微電極。微電極法測量pH值是通過將微電極直接刺入待檢測組織或細胞中進行pH值的測量。

3.1.1原理pH敏感型玻璃微電極主要由玻璃微吸管、微參比電極和pH值敏感電極（內含氫離子交換劑）組成。微參比電極與氫離子交換電極共同構成測量電池。用于細胞內、外pH值測定的微參比電極尖端直徑分別為1～3 μm、50～100 μm。測定細胞內pH值時，將微電極插入待測細胞內，然后讀取兩電極間的電位差數值，經過相應的計算后即可得出所測pH值。

3.1.2優缺點

3.1.2.1優點①測量精確度較高，可精確到0.02～0.05個pH單位，并且校準比較簡單。②時間分辨力高，既可反映pH的瞬時變化，又可持續監測細胞內pH值變化。③可同時記錄細胞膜電位的改變，提供細胞功能的其他信息［32］。④微電極體積較小，較適合實驗室的常規使用。

3.1.2.2缺點①具有有創性。微電極必須插入組織或細胞中才能實現對細胞外液或細胞內液中pH值的測量，必然造成組織或細胞的損傷，限制了其臨床應用。②測量誤差來源多，穿刺時微電極易被堵塞導致細胞液無法與pH敏感電極充分接觸；穿刺損傷導致細胞液滲漏，細胞內、外液混合導致pH值改變；灰塵、油污或細胞膜物質等附著于微電極的活性表面導致pH敏感電極的敏感性降低。③重復使用率低。使用過程中氫離子交換劑不斷逸失，電極功能衰退較快，因此平均工作壽命短，在一次實驗過程中往往需要使用數個電極［33］。④技術操作難度大。測量細胞內pH值時必須保證微電極的活性表面僅與細胞內部液體接觸，同時要避免受到細胞外液影響；操作時要借助顯微鏡進行觀察，對操作者的操作水平也有較高的要求；受微電極尖端直徑的限制，待測細胞的胞徑也不能過??；由于操作復雜，所需時間較長，因此無法實現細胞內多個位點的pH值測定。

3.1.3研究進展微電極的發展主要依賴于其制作材料的發展，隨著制作材料的不斷改進，諸如鈉、鉀、鈣離子敏感玻璃微電極等pH測量微電極以外的微電極也逐漸被開發出來，有的微電極同時整合了多種測量功能，大大方便了基礎和臨床研究，并拓展了其在生物學研究中的應用。微電極為研究鈉、鉀、鈣等離子在細胞內外的濃度及其與pH值的相互關系、細胞內外離子跨膜轉運的機制［34］等提供了有效手段。微電極的發展還衍生出了神經細胞電生理技術［35］，為研究者在神經細胞的研究提供了一大助力。目前，微電極的應用多集中于實驗室，在臨床方面的應用有待發展。

3.2熒光光譜法熒光光譜分析是根據物質的熒光譜線的性質及其強度進行物質鑒定和含量測定的方法。

3.2.1原理熒光染料一般通過擴散進入細胞，在細胞內發生水解等改變后生成熒光素分子，熒光素分子能夠吸收一定波長的光子并躍遷入激發態，之后能量會以較長波長的光發散出來，熒光素分子與質子發生作用后引起熒光的變化，因此熒光的強度與隨著細胞內的pH值的變化而變化。采用特定的儀器（如激光共聚焦顯微鏡）檢測細胞內的熒光強度，再參照校準曲線，即可得出被測細胞內的pH值［36］。

3.2.2優缺點

3.2.2.1優點①測量精確度高，可精確到0.01個pH單位。②空間分辨率高，具有200 nm的空間精確度，因此能夠給出細胞內pH值的二維甚至三維地圖。③時間分辨率高，具有毫秒級的時間精確度，可實時監測細胞內多個位點的pH值變化［6］。④技術操作較簡單，該法不受細胞濃度和大小的限制，操作相對簡單，重復性較好。⑤可以測定數個細胞或大量細胞的pH值。⑥較適合實驗室的常規使用。

3.2.2.2缺點①盡管此法不像微電極法那樣對組織或細胞造成直接的穿刺損傷，但染料與細胞分子的螯合反應還是會改變細胞的原本結構，處理不慎還可能污染細胞；另外，部分熒光染料產生紫外區的熒光，會損傷活體樣品［37］。②測量存在一定的誤差，原因與染料種類、濃度和實驗條件（溫度和時間等）密切相關，必須根據被測組織細胞的不同及時調整前述參數；并且根據測定熒光強度的儀器的不同，須采用不同的校準曲線［38］。③不能用于細胞膜電位的測定。

3.2.3研究進展熒光光譜法的進展主要依賴于熒光染料（又稱熒光探針）的開發［37］，早期羧化半萘羅丹明類熒光染料等應用較為廣泛［6］，隨后碳菁型pH熒光探針等更新的熒光探針不斷被開發出來［39］，使得該法的組織細胞pH成像更加清晰。然而，用于檢測細胞內酸性器官（如溶酶體、內涵體等）的理想的pH探針目前幾乎沒有，因此影響了該法在生物醫學應用上的發展。

4　小結

MRI因其無創性及可獲取組織細胞其他代謝活動信息的優勢，迅速而廣泛地應用于臨床，為疾病的診斷和療效評價等做出了突出的貢獻。從最早可測定組織細胞內pH值的31P-MRS，到后來興起的CEST成像技術及其分支APT成像技術，因此結合了物理學、化學和生物學的MRI技術當之無愧地成為目前生物醫學和臨床醫學領域最受矚目的技術方法，前景廣闊［40］。雖然微電極法和熒光光譜法測量pH值在臨床上的應用遠不如MRI法，但相對于依賴MR設備等硬件設施的MRI法，這兩種方法在普通實驗室的應用卻更為廣泛，并且在研究單細胞等方面擁有特殊優勢。

總之，準確測定組織細胞內外pH值具有重要意義，尤其是在活體情況下進行的測定。本文所介紹的這些測量方法各有其優缺點，進行相關實驗時，研究者要熟悉所選方法的原理，選擇合適的技術方法，并且在實驗過程中注意揚長避短，以幫助實驗的順利進行。

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（收稿2015-09-09）

Research progress in methods of pH measurement in tissue cells

WU Peiqi1，2，LIANG Changhong2.1 Southern Medical University，Guangzhou 510515，China；2 Guangdong General Hospital，Guangdong Academy of Medical Sciences

As an important parameter of body fluid，the hydrogen-ion concentration closely related to the function of tissue cells.Thus accurately measuring the pH，inside or outside cells，is very important for early diagnosis and treatment. The most commonly used methods which can measure the pH of tissue cells include magnetic resonance，microelectrodes，and fluorescence spectrometry.We summarized the principle，advantages and disadvantages for each method，and introduced the research and application progress，aiming to provide some references for related experimental study.

PH measurement；Magnetic resonance spectroscopy；Chemical exchange saturation transfer；Amide proton transfer；Microelectrodes；Fluorescence spectrometry

國家自然科學基金（81271654），NSFC-廣東聯合基金（U1301258）

10.19300/j.2016.Z3717

R445.2

A

1南方醫科大學，廣州 510515；2廣東省人民醫院 廣東省醫學科學院

梁長虹，E-mail：cjr.lchh@vip.163.com

*審校者