乙型肝炎病毒多聚酶/反轉錄酶區耐藥突變研究進展

趙 麗，蘇何玲，劉 妍，徐東平

1.桂林醫學院，廣西 桂林 541004； 2. 解放軍三〇二醫院臨床研究管理中心

乙型肝炎病毒多聚酶/反轉錄酶區耐藥突變研究進展

趙 麗1，蘇何玲1，劉 妍2，徐東平2

1.桂林醫學院，廣西 桂林 541004； 2. 解放軍三〇二醫院臨床研究管理中心

目前臨床最常用的抗乙型肝炎病毒(HBV)藥物是核苷(酸)類似物(NAs)，但長期使用可導致HBV發生基因突變引起耐藥，導致治療失敗。HBV多聚酶/反轉錄酶(RT)區是NAs藥物治療作用的靶點，公認的耐藥突變也都發生在RT區內。不同NAs藥物的耐藥形式往往不同，但也存在交叉耐藥和多重耐藥突變形式。深入觀察抗病毒治療過程中耐藥突變及演變規律，分析各種突變形式的表型特點及其與臨床表現的關系，用靈敏方法對患者病毒RT區耐藥相關突變進行動態監測，早期發現HBV耐藥，合理進行挽救治療，對慢性乙型肝炎治療具有重要意義。

乙型肝炎病毒; 耐藥；突變；抗病毒治療

慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染仍然是一個嚴重的全球性的公共衛生問題。目前治療HBV的藥物有兩大類：α-干擾素和核苷(酸)類似物(NAs)。NAs分為核苷類似物和核苷酸類似物，前者包括拉米夫定(LAM)、替比夫定(LDT)和恩替卡韋(ETV)，后者包括阿德福韋酯(ADV)和富馬酸替諾福韋酯(TDF)等，NAs由于抑制病毒復制作用較快、服用方便、副作用低而廣泛用于臨床治療，但需長期服用可產生病毒耐藥[1]。本文主要就目前NAs治療過程中出現的耐藥研究進展，結合課題組研究結果，作一概述。

1 核苷(酸)類似物耐藥機制

HBV是一種小分子,部分雙鏈環狀的DNA病毒，屬于嗜肝DNA病毒屬。在HBV復制過程中，由于其高復制率及RT校對功能的缺乏，具有高變異特性。雖然NAs抑制HBV復制的效果較強，但對HBV復制的原始模板共價閉合環狀DNA(cccDNA)無直接作用，需長期使用，可引起病毒發生突變，其中對藥物壓力適應性強的變異病毒可獲得選擇性擴增，產生耐藥突變，導致臨床抗HBV治療失敗[2-3]。目前抗HBV藥物NAs作用靶點均在病毒的多聚酶/逆轉錄酶(RT)區，已知的耐藥相關突變也均位于RT區。NAs耐藥分為原發耐藥突變和繼發耐藥突變(又稱為復制力補償突變)兩種。前者直接引起病毒對藥物敏感性的下降，后者的主要作用是恢復因原發耐藥突變引起的自然復制力下降。HBV發生耐藥突變后，可先后引起病毒學突破和生化學突破，在診斷病毒耐藥突變過程中，根據檢測方法的不同，將HBV耐藥分為基因型耐藥和表型耐藥，基因型耐藥指的是在抗病毒治療過程中檢測到公認的與NAs相關的HBV耐藥基因突變；而表型耐藥是指在體外分別將帶有野生和耐藥相關變異的HBV基因組重組質粒轉染支持HBV復制的細胞中(如HepG2)證實，并加入梯度藥物，比較藥物的敏感性，出現與基因耐藥相關的抗病毒藥物敏感性降低，以半數有效濃度( EC50) 表示[4]。除此之外，NAs耐藥突變的產生與患者的藥物代謝差異及免疫狀態等方面也存在一定關聯。

2 LAM相關耐藥突變

LAM屬于胞嘧啶類核苷類似物，作為第1個獲得美國FDA批準的口服抗病毒藥物，它的出現給廣大的HBV感染者帶來了福音。但作為第1代NAs類抗HBV藥物，LAM的耐藥基因屏障最低，病毒的相關耐藥發生率最高。聯合使用其他核苷(酸)類似物，如LAM+ADV可顯著降低其耐藥發生的風險[5]。目前發現LAM原發耐藥公認的位點是YMDD即聚合酶區rtM204V/I，前者通常伴隨L180M繼發耐藥突變，而后者常單獨出現或伴隨rtL80I繼發耐藥突變，rtM204V和rtM204I突變HBV對LAM敏感性的下降通常超過500倍。除此之外，有報道過其他形式的LAM相關突變，我們課題組[6]對發生rtL229突變的慢性乙型肝炎患者的樣本HBV進行測序，發現一些患者出現rtM204I+rtL229突變株共存，通過構建體外rtL229有關表達載體，經LAM處理，發現rtL229F突變伴隨rtM204I出現在LAM的治療過程，對LAM敏感性影響不大，但rtL229F可以恢復rtM204I突變株的復制能力，證實rtL229F是LAM耐藥相關的繼發突變。我們還發現rtM204Q突變是一種新型的LAM耐藥突變模式，在對大樣本患者篩查中發現，有7例LAM耐藥患者出現rtM204Q單獨突變，或聯合經典的LAM耐藥突變，表型分析結果顯示rtM204Q的LAM EC50與野生株增加了78倍，是一種新的LAM原發耐藥突變模式，由于rtM204Q突變對ADV具有敏感性，因此在臨床上除了可以采用TDF挽救治療方案外，也可以采用ADV或ADV+LAM挽救治療方案[7]。

在長期的用藥研究中，針對慢性乙型肝炎患者發生LAM耐藥的補救治療方案的選擇十分重要。2012年的一項研究顯示，LAM耐藥患者采取的4種補救治療方案中，經ADV+ETV補救治療后耐藥率最低，但在我國臨床上最常使用的卻是ADV單一療法[8]。同時由于YMDD突變株在慢性感染治療過程中易引起耐藥性，因此在患者發生病毒學和生化突變前檢測出該病毒株突變模式有助于臨床及時調整和提高治療效果。LAM耐藥型與野生型病毒一樣具有水平傳播力，一個直接的證據是在少數未接受NAs治療的急性乙型肝炎患者樣本中檢出了LAM耐藥株。

本課題組Xu等[9]對201例未接受過NAs治療的急性乙型肝炎患者血清進行分析，通過直接測序并通過克隆測序證實14例陽性耐藥患者中有11例出現了LAM耐藥突變模式rtM204I/V。此外Baxa等[10]也在未接受過抗病毒治療的慢性乙型肝炎患者中檢測到少數患者發生耐藥突變。這些研究均表明LAM耐藥株具有水平傳播能力。

3 ADV相關耐藥突變

ADV是一種中效的抗HBV藥物,其基因耐藥屏障也較低，在我國廣泛用于LAM耐藥患者和慢性乙型肝炎的初治過程中,HBV感染患者接受ADV 治療 1、2、3、4、5 年 HBV 累積耐藥率分別為 0、3%、11%、18%、29%，一旦發生耐藥，臨床則考慮換藥或與其他核苷類藥物聯合治療[11]。目前，公認的經典的ADV耐藥突變為rtA181V和rtN236T，其中rtN236T突變主要發生在B基因型HBV感染中，而且發現大部分ADV耐藥突變都是兩個或兩個以上[12]。此外，有研究提示還存在其他ADV相關耐藥突變形式。本課題組Liu 等[13-14]通過大樣本臨床耐藥檢測分析、臨床隨訪監測結合表型耐藥分析，發現并鑒定了兩種新的ADV原發耐藥突變模式，即rtA181S和rtN236V，其中通過測序分析大樣本的慢性乙型肝炎患者，檢出帶有rtA181S突變的患者占有率為0.53%(98/18 419)，其在經ADV 治療過的5 344 例患者中占0.86%(46/5 344)，通過TA 基因克隆分析RT區，檢測發現在發生病毒學突破時有6 例患者均出現rtA181S 突變，表型耐藥分析rtN236T、rtA181S、rtA181V 和rtA181S+rtN236T突變株的EC50分別是野生株的7.9倍、3.7倍、5.6倍、9.8倍，提示rtA181S是一種中等ADV相關耐藥突變。由于rtA181S突變對LAM、ETV、TDF 3種藥物敏感，在2例發生rtA181S突變的患者中采取ETV和LAM+ADV挽救治療方案，發現ETV和LAM+ADV用藥能夠有效的抑制病毒復制，但LAM+ADV聯合用藥不能減少rtA181S的突變比例，治療過程中rtA181S突變株持續存在，提示ETV挽救治療可能更有效。同年課題組在6例ADV難治性患者中檢測到rtN236V突變，表型耐藥分析顯示rtN236V突變是一種新型少見的ADV耐藥突變，其與rtA181S突變類似。

此外，本課題組[15]對18 419例患者分析發現rtI233V突變與ADV耐藥相關，測序檢測出rtI233V突變在經ADV治療和未接受治療的患者中分別為38/344、8/13 075(P<0.01),克隆測序發現8例經ADV治療過的患者在發生病毒學突變時均檢測到rtI233V±rtA181V/rtN236T突變存在，表型耐藥顯示rtI233V、rtN236T、rtI233V+N236T突變株對ADV的耐藥倍數是野生株的2倍、6.82倍、5.28倍，在ADV用藥過程中rtL233V、rtN236T、rtI233V+N236T突變株的復制能力與野生株相比分別為97.5%、30.2%、69.7%。發現rtI233V突變雖然對ADV的敏感性低，但能夠恢復rtN236T突變株的復制能力，提示rtI233V突變可能是一種新的ADV相關的替換突變。由于rtA181S、rtN236V、rtI233V 3種突變均對LAM、ETV、TDF敏感，在針對發生rtA181S、rtN236V、rtI233V突變的ADV耐藥患者中，臨床均可以使用ETV挽救治療，抑制病毒復制，使ALT恢復至正常水平。

根據最新的慢性乙型肝炎防治指南[16]在針對ADV耐藥治療失敗的患者，可以采取以下兩種挽救方案:(1) 針對發生ADV耐藥，但之前未使用LAM的患者，可以換用ETV或TDF; (2) 針對治療LAM/LdT耐藥時出現的ADV耐藥患者，可以換用TDF或ETV+ADV。

4 ETV相關耐藥突變

ETV是一種高基因屏障NAs藥物，是所有抗HBV藥物中發生耐藥最低的。據統計其在初治患者中6年耐藥率僅1.2%，但在作為LAM耐藥患者的挽救治療中6年耐藥率達60%[17]。目前認為ETV耐藥是在LAM耐藥基礎上出現的，當出現LAM敏感的突變位點時，病毒對ETV的敏感性會下降[18]。ETV耐藥多在rtL180M、rtM204I/V的基礎上出現3個以上的位點突變，如rtT184A/G/F/I/L/S、rtS202C/G/I或rtM250I/L/V。此外，Hayashi等[19]從對1例ETV難治性患者的血清樣本中發現了2種可能與ETV耐藥相關的新型突變rtI163V和rtA186T的存在,該突變伴隨LAM耐藥出現。將發生病毒學突破的樣本血清接種到小鼠中，通過構建小鼠模型，動態監測證實rtA186T突變與ETV耐藥密切相關，能夠降低HBV聚合酶對ETV的親和力，而rtI163V突變與ETV耐藥不相關。上述研究均表明ETV耐藥與LAM耐藥相關，這可能對指導臨床聯合用藥有幫助，但是否存在其他ETV耐藥有待研究。

在長期用藥研究中，臨床上長期使用ETV抗病毒治療安全有效，通過對慢性乙型肝炎患者使用5年的ETV療效觀察，發現除了 TDF以外，ETV相比其他抗病毒藥物對HBV DNA的抑制作用更強，其耐藥率低，因此推薦ETV作為第一線抗病毒藥物治療[20]。

5 TDF相關耐藥突變

TDF是與針對人免疫缺陷病毒1型和HBV的NAs藥物。TDF是目前耐藥基因屏障最高的藥物之一，其抗病毒治療效果強，幾乎不發生耐藥。迄今為止，尚未有證實的有關TDF耐藥突變形式存在。以往有研究提出rtA194T[21-22]為TDF耐藥相關突變，但未獲得公認。Murakami等[23]在有關TDF對發生HBV耐藥克隆的影響的研究中，發現TDF對rtA181T/ N236T的敏感性有所降低，TDF敏感性因HBV基因型和耐藥性HBV克隆的不同而不同。此外，最新研究發現經TDF治療后，約60%的病毒血癥患者中檢測到rtD263E突變存在，推測該突變可能是一種TDF應答不佳相關突變形式[24]。

6 NAs多重耐藥突變

多重耐藥突變是指在HBV基因組上同時出現了針對核苷類和核苷酸類抗HBV藥物的耐藥突變。目前，隨著NAs抗病毒藥物的廣泛使用，LAM、ADV、ETV、TDF幾代藥物頻繁應用于臨床慢性乙型肝炎感染的治療過程，其中LAM、ADV作為低耐藥基因屏障藥物，其耐藥發生率呈上升趨勢，在針對耐藥突變而采取的挽救治療或其他原因而應用的多種NAs治療的慢性乙型肝炎患者體內，可能存在針對多種藥物聯合治療而引發的耐藥突變。

本課題組Liu等[25]在回顧性分析大樣本慢性乙型肝炎患者中，在經LAM、ADV、ETV及LAM+ADV聯合治療的患者體內檢測到rtL180M+A181V+S202G+M204V+N236T、rtL180M+S202G+M204V+N236T兩種帶有LAM和ADV耐藥的多重耐藥突變的病毒株，該病毒株對LAM、ETV、ADV單一治療和LAM+ADV聯合治療的敏感性下降。在此之前，本課題組[26]報道了1例發生多重耐藥的慢性乙型肝炎患者，通過動態監測患者NAs用藥和多重耐藥發生的演變過程，發現ETV耐藥不僅在LAM耐藥突變基礎上出現，而且能夠加速LAM耐藥突變的出現。在經LAM、ADV、ETV序貫治療過程中患者由單一耐藥突變發展到多重耐藥突變?？寺y序共檢出33種病毒突變株，其中3種為多重耐藥突變株，即rtL180M+A181V+S202G+M204V+N236T、L180M+S202G+M204V+N236T和L180M+A181V+S202G+M204V的存在。我們通過對大樣本的測序篩查，在40例患者樣本中共檢出了11種多重耐藥突變形式，采用ADV+ETV治療對多重耐藥HBV感染有較好的抑制效果[27]。Kim 等[28]研究經LAM、ADV、ETV單一治療和LAM+ADV挽救治療后發生多重耐藥突變的患者，分析6例接受過LAM+ADV挽救治療的患者，通過體外克隆實驗，發現大部分多重耐藥突變發生在不同的基因組，提示LAM+ADV補救治療效果可能與多重耐藥株突變基因位點無關，而取決于藥物潛在的低抗病毒阻力，因此認為有效的聯合用藥對多重耐藥患者是一種有效的補救治療。

當前，隨著NAs在臨床抗病毒治療過程中的廣泛使用，針對HBV感染患者的治療方案也發生了很大的變化，從以往一用藥到現在聯合用藥。雖然在一定程度抑制了疾病的進展，取得一定的臨床療效。但由此引發的耐藥突變問題變得也更為復雜，同時帶來的經濟問題也給廣大患者造成了一定負擔。為此，需要臨床醫生提高對HBV耐藥發生的認識，以采取有效的應對措施減少耐藥發生，提高抗HBV治療效果。

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(責任編輯：王全楚)

The progress of drug resistant mutation in polymerase/reverse transcriptase of hepatitis B virus

ZHAO Li1, SU Heling1, LIU Yan2, XU Dongping2

1．Guilin Medical University, Guilin 541004; 2.Center for Clinical Research and Translational Medicine, 302 Hospital of PLA,China

Currently nucleos (t) ide analogs (NAs) are most common anti-hepatitis B virus (HBV) drug used in clinic. However, the requirement of long-term use may lead to treatment failure due to drug-resistant mutation of the virus. As HBVpolymerase/reverse transcriptase is the target for anti-HBV NAs, drug-resistant mutations occur in this region. Different NAs usually have individual mutational patterns, while cross and multiple drug-resistant mutational patterns also exist. It is important for valid management of chronic hepatitis B by carefully observing occurrence and evolution of drug-resistant mutants during anti-HBV therapy, using sensitive assays for early detection and dynamical monitoring of viral resistance, and therefore conducting reasonable rescue therapy on time.

Hepatitis B virus; Drug resistance; Mutation; Antiviral therapy

國家自然科學基金面上項目(81371852)

趙麗，碩士研究生，研究方向：主要從事乙肝病毒基因變異方面的研究。E-mail: zhaoli302@sina.cn

徐東平，研究員，E-mail: xudongping302@sina.com；劉妍，副研究員，E-mail:Liuyan5360@163.com

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.11.029

R512.6+2

A

1006-5709(2016)11-1317-04

2016-03-17