黑素細胞培養研究進展

靳旺洋，訾紹霞，劉愛英

黑素細胞培養研究進展

靳旺洋，訾紹霞，劉愛英

靳旺洋

黑素細胞培養可對皮膚科及相關科室臨床及基礎研究提供一個良好的科研模型，同時對美容藥物開發也提供了很好的基礎。黑素細胞培養方法多種多樣，實際應用中需要添加各種添加劑來滿足黑素細胞的生長，而不同的添加劑可對黑素細胞產生不同的影響。在實際培養時需要根據目的來選擇不同的添加劑。

黑素細胞；添加劑；細胞培養；細胞因子

[J Pract Dermatol, 2016, 9(6):391-393]

黑素細胞分布廣泛，存在于人體多種組織，可見于表皮、毛囊、眼、血管周圍、外周神經及交感神經干、軟腦膜等結構。黑素細胞來源于外胚層的神經嵴[1]，在胚胎8～10周時逐漸遷移至皮膚，在成人表皮基底層中的黑素細胞總數約為20億，約占表皮細胞總數的2%～3%[2]。黑素細胞的主要功能是在黑素小體合成黑素顆粒，黑素顆粒進入角質形成細胞后像傘樣或者帽樣覆蓋于細胞核頂上方，保護細胞核免受紫外線輻射損傷[3]。離體培養的黑素細胞為在體外研究各種因素對黑素細胞的增生、酪氨酸酶的活性、色素代謝的影響及黑素細胞形態的變化提供了重要的細胞模型。黑素細胞占皮膚比例較小，且分裂能力較低，因此黑素細胞體外培養比較困難。體外培養時過度增生的角質形成細胞和成纖維細胞使黑素細胞在體外環境下生長增生更加困難[4]。隨著科技的發展，體外培養黑素細胞的技術和體系逐步得到優化，為研究皮膚病理生理學、皮膚細胞惡性轉化、藥物篩選及治療提供了重要的手段和良好的模型，具有很強的科研價值。在黑素細胞體外培養時經常會添加各種添加劑來調節細胞的生長，如各種細胞因子、某些低濃度的致癌劑等，來充當黑素細胞的有絲分裂劑。本文對健康人表皮黑素細胞體外培養中輔助添加劑的作用作一綜述，以期作為黑素細胞培養的參考。

1 細胞因子對黑素細胞的影響

1.1 堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）對黑素細胞的影響

bFGF 不僅是黑素細胞的促分裂劑，還是酪氨酸酶受體和蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）的激活劑[5]，刺激黑素細胞色素的生成及樹突生長。Abdel-Malek等[6]發現在黑素細胞培養液中加入bFGF可促進黑素細胞的增生，同時發現bFGF能促進黑素細胞樹突的形成。有研究證明，bFGF還能增加黑素細胞酪氨酸酶的活性，且對黑素細胞的作用有最適濃度，分別為0.6 μg/L（促增生）、1.5 μg/L（促酪氨酸酶合成）[7]。bFGF對靶細胞發生效應的可能機制為：bFGF與相應受體結合后，①激活腺苷酸環化酶與鳥苷酸環化酶；②激活磷脂酶C，通過肌醇脂代謝途徑產生第二信使(三磷酸肌醇和甘油二酯)，導致蛋白激酶C激活，鈣離子內流；③與bFGF相關聯的酪氨酸激酶活化而發揮作用；④bFGF與受體結合后產生配體受體復合物胞吞，胞吞后的bFGF大部分被進一步轉位至細胞核，影響RNA聚合酶Ι，加強核糖體的轉錄，以加速細胞由G0期到G1期和G1期到S期的轉換，刺激DNA合成增強，促使細胞的分裂與增生[4-17]。有學者嘗試用bFGF作為培養基的組分進行黑素細胞的培養，發現能更有效地培養出黑素細胞，細胞從接種到貼壁的時間較短，1周就能進入指數生長期；且發現小牛血清可進一步地增強這種促進作用[8]。因此黑素細胞培養時可以適量添加bFGF，但其最適濃度目前尚無明確的數據。

1.2 α-促黑素細胞刺激素對黑素細胞的影響

α-促黑素細胞刺激素（α-melanophore stimulating hormone，α-MSH）能提高黑素細胞內環磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）水平，進而促進黑素細胞的生長，并誘導其樹突的形成[9,11]；在含α-MSH的培養條件下，體外培養的黑素細胞形成樹突的數目增加，形態亦更接近于體內狀態[5]。

1.3 神經生長因子對黑素細胞的影響

黑素細胞在受到損傷時表達神經生長因子（nerve growth factor，NGF）受體，提示NGF可能是這類細胞的生存因子；有學者觀察到NGF不會促進黑素細胞的分裂[1,12,13]。學者分別用添加了NGF和抗NGF抗體（anti-NGF monoclonal antibody）的新鮮培養基培養黑素細胞，發現對黑素細胞樹突數量和細胞間接觸并無影響[14]。NGF可以使黑素細胞磷酸化[15]，從而影響黑素細胞的功能。因此培養液中是否必須添加NGF還有待進一步探索。

1.4 內皮素-1對黑素細胞的影響

內皮素-1（（endothelin-1，ET-1）可以促進黑素細胞生長、黑素合成、黑素細胞樹突形成、細胞黏附[16]。因此在培養基中添加ET-1可以形成一個合適的環境，以促進黑素細胞的增生，但其最適濃度可能需要根據培養目的的不同來調整。

1.5 白細胞介素對黑素細胞的影響

白細胞介素（IL）-4對體外培養的正常人表皮黑素細胞活力有抑制作用，能使細胞增生能力降低，黑素合成減少，增加黑素細胞的凋亡率[17]。IL-6對體外培養的正常人表皮黑素細胞活力有抑制作用，能使細胞增生能力降低，黑素合成減少，增加黑素細胞的凋亡率[18]。IL-8 對體外培養的正常人表皮黑素細胞活力有增強作用，能使細胞增生能力和黑素合成增加，但對黑素細胞的凋亡率無顯著影響[19]。濃度適當時，IL-10對體外培養的正常人表皮黑素細胞的增生起到促進作用；而IL-22和IL-23在高濃度時對體外培養的正常人表皮黑素細胞的生長和酪氨酸的活性均有抑制作用[20,21]。有研究表明，一定濃度的IL-23對體外培養的正常人表皮黑素細胞的增生起抑制作用，并有促進細胞凋亡，抑制酪氨酸酶活性的作用[22]。角質形成細胞分泌的物質可以調控黑素細胞的增生與分化，有研究表明角質形成細胞分泌的IL-33可直接或間接抑制黑素細胞的增生[23]。

1.6 腫瘤壞死因子對黑素細胞的影響

腫瘤壞死因子α對黑素細胞活力有抑制作用，能使細胞增生能力降低，黑素合成減少，增加黑素細胞的凋亡率[24,25]。有學者用IL-17 和腫瘤壞死因子作用于體外培養的正常人表皮黑素細胞，發現IL-17和腫瘤壞死因子可協同影響黑素細胞的增生和黑素合成[21]。

2 霍亂毒素與十四烷酰佛波醇己酯

2.1 霍亂毒素對黑素細胞的影響

1982年Eisinger和Marko首次報告成功大量培養出了黑素細胞，所用的培養液中就添加了霍亂毒素（cholera toxin，CT）[26]，CT可增加黑素細胞cAMP的水平[12-13,26]，促進黑素細胞DNA的合成。

2.2 十四烷酰佛波醇己酯對黑素細胞的影響

同樣Eisinger和Marko的培養液中也添加了十四烷酰佛波醇己酯（phorbol myristate acetate，TPA），TPA能促進黑素細胞的附著和增生，而抑制角質形成細胞的附著和增生。有學者用不含CT和TPA的培養基（Mel-mix培養基）成功培養出了黑素細胞，并與含CT和TPA的培養液培養出的黑素細胞的相關指標做了比較，結果顯示Mel-mix培養基在某些方面優于傳統含有CT和TPA的方法。

CT和TPA在促進細胞增生的同時具有細胞毒性，且有致癌的風險，限制了其在黑素細胞移植方面的應用。目前很多學者在研究不添加此兩種成分能否培養出滿意的黑素細胞。有學者用添加了白血病抑制因子（leukaemia inhibitory facyor，LIF）和毛喉素（forskolin）的基礎培養基成功培養出了大量活力良好的黑素細胞[27]，可以避免使用CT或TPA等具有毒性的物質。

3 小結

黑素細胞培養作為研究色素性皮膚病甚至皮膚相關疾病的一個手段，其培養方法隨著科技的進步會更加完善。不同的培養液及添加成分會對黑素細胞造成不同的影響，因此需要根據研究目的或應用目的來選擇不同的培養液及添加成分[28]。目前對于實驗室研究，添加CT 和TPA的培養基是比較常見的，目前仍有應用。多數是在基礎培養基（MCDB153，1640等）加入相應濃度的CT或者TPA及其他輔助的物質。目前也有公司專門生產黑素細胞培養產品：Promocell 公司的黑素細胞培養基分為含TPA和不含TPA兩種。M-254-500培養基也是一個已經上市的黑素細胞培養基。對于白癜風患者的細胞移植，有學者用F12培養基添加bFGF，CT，胎牛血清等物質可以成功培養出供移植的細胞[29]。M-254-500培養基也是一個已經上市的黑素細胞培養基。也可用DMEM培養液培養表皮混懸液來進行細胞移植。黑素細胞培養過程復雜，培養液的配制是整個過程的關鍵，但僅僅配制好培養液是不夠的，還需要做好以后每一步來確保細胞順利生長。實驗者應該在培養開始時，認真查閱文獻，甚至將實驗的每一步寫在紙上，在實驗時嚴格按照預定步驟操作，總結經驗和教訓，不斷改進。

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Research progress on melanocyte cell culture

JIN Wang-yang，ZI Shao-xia，LIU Ai-ying
North China University of Science and Technology, Tangshan 063300, China

Melanocyte cell culture provides a good model for the research of dermatological department and related departments, also for the development of beauty products. Today, there is a variety of melanocyte cell culture methods can be used. In the practical application, various additives may be added to meet the growth of the cells, and different influence can be seen when different additives to be used, so additives should be selected according to the different purposes.

Melanocyte；Additive；Cell culture；Cell factor

R331

A

1674-1293(2016)06-0391-03

2016-07-18

2016-10-30）

（本文編輯 敖俊紅）

10.11786/sypfbxzz.1674-1293.20160612

063300 唐山，華北理工大學研究生院（靳旺洋），煤炭總醫院皮膚科（訾紹霞，劉愛英）

靳旺洋，碩士研究生，研究方向：色素性疾病的基礎與臨床研究，E-mail: 526584536@qq.com

劉愛英，E-mail: laydlr@163.com