降解菌Pseudomonas sp.對阿特拉津的降解條件優化

劉丹丹，劉 暢，劉長風，李欣燕

（沈陽化工大學環境與安全工程學院，遼寧沈陽110142）

降解菌Pseudomonas sp.對阿特拉津的降解條件優化

劉丹丹，劉 暢，劉長風，李欣燕

（沈陽化工大學環境與安全工程學院，遼寧沈陽110142）

為微生物降解菌在農藥污染土壤修復工程中應用提供參考，以從長期受阿特拉津污染的農田土壤中篩選出的一株降解菌Pseudomonas sp.為研究對象，采用單因素試驗研究其在不同培養條件下對阿特拉津的降解效果，并采用正交試驗進一步優化該菌的降解條件。結果表明：碳源對降解效果的影響不大；培養時間48h，底物濃度100mg／L，溫度25～35℃，pH 5.0～8.0，鹽度0.1%～1%時，該菌對阿特拉津的降解效果較好，降解率大于90%；該菌對阿特拉津降解的最佳組合條件為溫度30℃，pH 7.0，鹽度0.5%；且3因素對降解效果的影響依次為溫度＞pH＞鹽度。

Pseudomonas sp.；微生物降解菌；阿特拉津；農藥殘留；環境污染；降解力

阿特拉津是世界范圍內應用最廣泛的除草劑之一，常被用于玉米、高粱、甘蔗、茶園、果園、紅松苗圃及林地等種植地去除一年生禾本科雜草和闊葉雜草［15］。阿特拉津屬三嗪類化合物，施用后在環境中的礦化時間可長達57個月［6］，長期施用造成嚴重的環境污染，在土壤、地表水和地下水體等環境介質中均有檢出［711］。阿特拉津在環境中的長效殘留特性，嚴重危害生物安全。毒理學試驗表明，阿特拉津能夠干擾人和動物的內分泌系統［1214］，同時具有潛在的致癌和致畸特性［15］。因此，先后被許多國家和組織列為優先控制污染物或禁止使用［1618］。

為有效去除環境中阿特拉津的殘留及其危害，利用降解性微生物修復阿特拉津污染的研究越來越多。1994年，菌株Pseudomonas sp.YAYA6被報道能夠完全降解阿特拉津，并能夠利用阿特拉津作為唯一碳源生長［19］。迄今為止，已發現大量與阿特拉津降解相關的微生物［2023］。利用微生物治理阿特拉津污染不僅避免了傳統污染治理中的二次污染，且兼具經濟高效等優點，發展前景好。為此，筆者以前期試驗中從遼寧地區長期施用阿特拉津農田土壤中分離獲得的高效阿特拉津降解菌株Pseudomonas sp.為研究對象，以阿特拉津降解率為衡量指標，采用單因素試驗研究該菌在不同培養條件下對阿特拉津的降解效果，并在此基礎上采用正交試驗進一步優化該菌的降解條件，旨在為更好地應用降解菌株進行阿特拉津污染土壤的生物修復提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 菌株降解菌株Pseudomonas sp.，從遼寧地區長期施用阿特拉津的農田土壤中分離獲得。實驗室馴化培養，該菌株48h對阿特拉津的降解率可達94%，并且能以阿特拉津作為唯一氮源生長。

1.1.2 培養基無機鹽培養基：K2HPO41.6g、KH2PO40.4g、MgSO40.2g、NaCl 0.1g，葡萄糖3g，阿特拉津0.1g，定容至1 000mL，121℃高壓滅菌30min。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同培養條件降解菌株對阿特拉津的降解效果參照文獻［24－25］的方法進行。1）培養時間。將108CFU／mL降解菌轉接至阿特拉津含量100mg／L的無機鹽培養基，30℃連續避光培養，測定不同培養時間（0～72h）該降解菌株對阿特拉津的降解率，每6h測定1次，3次重復。2）底物濃度。降解菌接種至含阿特拉津50mg／L、100mg／L、200mg／L、400mg／L、800mg／L和1 200mg／L的無機鹽培養基，30℃培養48h測定阿特拉津降解率，3次重復。3）培養溫度?？疾?5℃、20℃、25℃、30℃、35℃和40℃等不同培養溫度對菌株降解阿特拉津能力的影響。采用1.1.2的無機鹽培養基培養48h，3次重復（下同）。4）pH?？疾靝H 3～11對阿特拉津降解效果的影響。5）鹽度。分別考察0.05%、0.1%、0.5%、1%、2%和3%培養基鹽度對阿特拉津降解的影響。6）碳源?？疾炱咸烟?、果糖、檸檬酸鈉、乳糖、蔗糖和淀粉為碳源對阿特拉津降解效果的影響。試驗調整1.1.2中培養基碳源，30℃培養48h測定阿特拉津降解率，3次重復。

1.2.2 阿特拉津降解條件優化選擇溫度、pH和鹽度3個因素，按照L9（34）正交表進行正交試驗，在100mg／L阿特拉津濃度下，以阿特拉津降解率為指標，研究菌株降解阿特拉津的最佳組合條件。

1.2.3 阿特拉津提取及含量測定參照文獻［26－27］的方法提取與檢測。其中，阿特拉津的提取采用等體積CHCl3萃取法；阿特拉津含量檢測采用高效液相色譜法，檢測條件為反相C18柱（4.6mm× 250mm），流動相為甲醇和水（V／V＝80／20），流速為1mL／min，柱溫25℃，進樣量10μL，檢測波長213nm。

1.3 數據統計與分析

試驗數據經DPS軟件和Microsoft Office Excel 2007軟件統計，并采用Duncan’s新復極差法進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同處理條件下降解菌對阿特拉津的降解效果

從圖1可見，不同培養時間、底物濃度、溫度、pH、鹽度和碳源處理對降解菌株Pseudomonas sp.降解阿特拉津的影響不同。

2.1.1 培養時間在培養初期阿特拉津降解率升高較快，48h時阿特拉津降解率超過90%，之后直至72h降解率變化不明顯，基本保持平穩。因此，菌株降解阿特拉津的有效時間為48h。

2.1.2 底物濃度隨著底物濃度升高，阿特拉津的降解率呈下降趨勢。其中，當底物濃度為50mg／L和100mg／L時，阿特拉津的降解率均較高；當底物濃度為200mg／L時，降解率降至58%；底物濃度為1 200mg／L時降解率降至10%以下。阿特拉津雖然可以為降解菌生長提供氮源，但其對菌體生長仍有生物毒性，超過一定濃度（＞200mg／L）將抑制菌株生長，出現阿特拉津降解受阻，降解率下降的現象。

圖1 不同培養時間、底物濃度、溫度、pH、鹽度和碳源處理降解菌對阿特拉津的降解效果Fig1. Degradation effect of culture time，substrate concentration，temperature，pH，salinity and carbon on Atrazine degradation of a Pseudomonas sp.strain

2.1.3 溫度隨著底物濃度升高，阿特拉津的降解率呈先上升后下降趨勢。當溫度在25～35℃時，阿特拉津的降解效果較好，表明降解菌有較強的溫度適應性。低溫和高溫對菌株降解能力均有不同程度的影響，但低溫對阿特拉津降解的影響更大，這與前人［2829］發現的很多降解菌株具有相似性。

2.1.4 pH隨著pH的升高，阿特拉津降解率總體呈先上升后下降的趨勢。溶液pH在6.0～9.0時，阿特拉津降解率較高，pH 7.0時降解率達最大，為96%?？梢?，降解菌具有較好的酸堿耐受性，但強酸和強堿環境仍不利于菌株降解能力的發揮。較強的酸堿環境對菌體細胞產生較大的滲透壓力，造成細胞溶質外滲和生長發育受阻等，從而影響菌株對阿特拉津的降解效果，出現降解率下降現象。

2.1.5 鹽度隨著鹽度升高，阿特拉津的降解率呈先上升后下降趨勢。菌株降解阿特拉津的適宜鹽度為0.1%～1%，在0.5%鹽度時阿特拉津降解率最高，為96%；高鹽（3%鹽度）明顯抑制阿特拉津的降解作用。當培養基中鹽度高于菌體細胞時可直接引起細胞失水，導致細胞運輸系統受損或使生物酶失活，影響菌體對營養物質的吸收和利用，造成阿特拉津降解率降低［27］。

2.1.6 碳源各碳源對阿特拉津降解率的影響依次為葡萄糖＞果糖＞檸檬酸鈉＞乳糖＞蔗糖＞淀粉。其中，葡萄糖為碳源的降解率最高，達97%；淀粉為碳源的降解率最低，為90%。表明，菌株可利用的碳源種類較寬，且利用能力較強。因此，碳源對阿特拉津降解效果的影響不大。

2.2 阿特拉津降解條件優化

從表1可見，A2B1C1、A2B2C2組合處理的降解率最高，分別達80.34%和76.26%，二者間差異不顯著。進一步極差分析得出，菌株降解阿特拉津的最佳組合條件為A2B2C2（表2），即：溫度30℃、pH 7.0、鹽度0.5%時，阿特拉津的降解效果最好。3個因素對阿特拉津降解的影響依次為溫度＞pH＞鹽度。

表1 阿特拉津降解條件正交試驗設計及其降解率Table1 Design and degradation rate of the orthogonal test for Atrazine degradation conditions

表2 阿特拉津降解條件正交試驗結果的極差分析Table2 Range analysis of orthogonal test results for Atrazine degradation conditions

3 結論與討論

該試驗菌株在實驗室培養48h對阿特拉津的降解率超過90%，表明，其是理想的高效降解菌株。因此，本研究豐富了阿特拉津降解的微生物資源。

單因素試驗結果表明，菌株降解阿特拉津的培養條件分別為培養時間48h，底物濃度100mg／L，溫度25～35℃，pH 5.0～8.0，鹽度0.1%～1%。碳源利用試驗表明，菌株有較寬的碳源利用譜，碳源對阿特拉津降解效果的影響不大。

正交試驗結果表明，菌株降解阿特拉津的最佳組合條件為溫度30℃，pH 7.0，鹽度0.5%，且3個因素對降解效果的影響依次為溫度＞pH＞鹽度。

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（責任編輯：王 海）

Optimization for Degradation Conditions of a Pseudomonas sp.Strain with Degrading Atrazine Ability

LIU Dandan，LIU Chang，LIU Changfeng，LI Xinyan
（Department of Environmental and Safety Engineering，Shenyang University of Chemical Technology，Shenyang，Liaoning110142，China）

The degrading Atrazine effect of a Pseudomonas sp.strain screened from the soil polluted with Atrazine for long time was studied under different culture conditions by the single－factor test anDThe degradation conditions were optimized by the orthogonal test to provide a reference for application of microbial degradation bacteria in restoration works of soil polluted with pesticides.Results：Carbon source has no obvious effect on degradation effect.The Atrazine degradation rate of the Pseudomonas sp.strain is more than 90%under the culture conditions of 48h，100mg／L substrate concentration，25～35℃，pH 5.0～8.0and 0.1%～1%salinity.The optimal condition combination of the Pseudomonas sp.strain includes 30℃，pH 7.0and 0.5%salinity anDThe influencing degree is temperature＞pH＞salinity.

Pseudomonas sp.；microbial degradation bacteria；Atrazine；pesticide residue；environmental pollution；degradation ability

S154.39；X172

A

1001－3601（2016）10－0421－0046－04

2016－04－14；2016－10－09修回

遼寧省博士科研啟動項目“土壤阿特拉津污染的微生物修復機制與工程菌株構建”（20141086）

劉丹丹（1981－），女，講師，博士，從事環境污染控制與修復研究。E－mail：liudandan.553＠163.com