分子親緣地理學及遺傳標記技術的應用

趙群

（皖西學院生物與制藥工程學院 安徽蕪湖 241000）

分子親緣地理學及遺傳標記技術的應用

趙群

（皖西學院生物與制藥工程學院 安徽蕪湖 241000）

本文論述了分子親緣地理學的產生和發展過程，以及國內外的研究進展，同時對遺傳標記特別是線粒體DNA分子標記技術進行了詳細闡述。

分子親緣地理學 遺傳標記技術 線粒體DNA

1 引言

1908年和1909年,英國數學家哈迪（Hardy）和德國醫學家溫伯格（Weinberg）分別提出在一個隨機交配的種群中,若不發生突變、遷移等因素,在經過傳代后初始基因或基因型頻率則始終恒定不變。在群體遺傳學研究的初期,由于研究手段的限制,人們沒有辦法探測長期進化后群體的遺傳變化。隨著分子生物學實驗技術應用于群體遺傳學,可以利用大分子序列,比如DNA 序列變異來進行群體遺傳學研究。

2 分子親緣地理學研究

2.1 親緣地理學

親緣地理學,又稱為系統發育生物地理學,是研究親緣關系相近的物種及種內不同種群形成現有地理分布格局的歷史原因和演化過程的一門學科。親緣地理學是生物地理學的一個分支,在解釋現有種群分布狀況的基礎上,進一步研究種群分布的原因,追溯其進化歷程,分析種群在時空上的發展變化,重建生物區系的歷史。它主要偏重于對近緣物種或種內的研究,在種內水平上描述種群的系統地理格局,進而追溯其形成原因,對物種擴散和遷移等微進化歷史等進行了有效的推測。

2.2 分子親緣地理學

由于分子生物學實驗技術及種群遺傳學等方法和原理的運用,使親緣地理學可以進一步從分子水平上描述種群地理格局的形成過程,探討種群分化的歷史,進而推測種群現有分布格局形成的原因。分子親緣地理學是通過分子生物學技術在分子水平上,研究種群內部地理格局形成的相關原因。

3 遺傳標記技術

3.1 遺傳標記技術的發展

在分子親緣地理學的研究的過程中,離不開遺傳標記。遺傳標記是指所應用的區別不同個體或種群,并且能穩定地遺傳的標記物。伴隨生物學實驗技術不斷發展與完善,遺傳標記的應用與研究也越來越成熟,在發展過程中,依次出現4種主要類型的遺傳標記,它們分別是形態學標記、細胞學標記、生物化學標記和DNA分子標記。

3.2 遺傳標記的類型

3.2.1 形態學標記

形態學標記是指在基因表型中可進行識別與目的性狀緊密相關的等位基因突變體。其主要包括質量性狀和數量性狀,簡單而直觀,目前仍然是研究很多物種的分類和起源分化關系的基礎。但形態學標記的數量很少,變異較小,如孟德爾在研究分離規律時所用的性狀只有兩種變異類型,不能隨機代表生物體的遺傳組成,且生物的表型特征是遺傳和環境相互作用的結果,不能直接反映真實的遺傳變異情況,所以形態學標記并不完善。

3.2.2 細胞學標記

染色體組型的分析對于遺傳多樣性的研究具有重要意義。通過對各個分裂期的染色體數目和一系列形態學參數研究,根據染色體特征分析可獲取相應的染色體組型。但由于染色體組行的差異型,可以用染色體組型作為形態學標記來研究生物的遺傳多樣性。

3.2.3 生物化學標記

在凝膠電泳技術產生和發展的過程中,生物化學遺傳標記技術也迅速發展起來,通過生物化學標記,把對遺傳多樣性的研究從宏觀深入到分子水平,并廣泛用于種群遺傳、雜交育種等各方面的研究。其中的同工酶電泳技術可以比較不同物種間基因表達產物的異同,并以此提示基因序列和功能差異。

3.2.4 DNA分子標記

隨著分子生物學和分子克隆技術的完善和發展,可以利用生物DNA編碼區及非編碼區作為遺傳標記,這種遺傳標記稱為DNA分子標記。DNA分子標記是DNA水平上遺傳變異的直接反應,其本質是反映生物個體或種群間基因組中某種差異特征的DNA片段。在DNA分子中,由于堿基的缺失、插入、易位、倒位、重排或存在長短和排列不同的重復序列等而產生多態性,通過不同的分子標記就可以檢測出這些多態性。

3.2.4.1 以分子雜交技術和電泳技術為核心的分子標記

（1）限制性片段長度多態性

主要是利用限制性內切酶對DNA進行處理切割,經酶切后DNA會形成特定大小的DNA片段,根據不同生物個體所產生的DNA片段的大小差異而構成其多態性。對于小分子DNA,如線粒體基因,可將其DNA樣品經適當的限制性內切酶處理后形成不同長度的片段,然后把處理后的產物進行瓊脂糖凝膠電泳分離,由于電泳遷移率不同便會在凝膠上形成連續的譜帶,不同植物個體來源的DNA 可形成不同的譜帶,從而表現出多態性。

（2）DNA指紋識別技術

是一種在單一實驗中可以檢測出大量DNA位點差異性的分子標記技術。在研究人的基因組文庫時,發現了一個DNA序列高變區,這類高變區在真核生物基因組中普遍存在,被稱為小衛星。小衛星序列的結構是由一較短的重復單位首尾相接、多次重復而成。由核心序列串聯重復構成的小衛星DNA 探針,可以同時與眾多的基因組的酶切DNA片段進行Southern雜交,得到含有多條圖帶的具有個體特異性的DNA雜交圖譜。

3.2.4.2 以電泳技術和PCR技術為核心的分子標記

（1）隨機擴增多態性

隨機引物擴增建立在PCR基礎上的尋找多態性DNA片段的分子標記技術。它利用一系列不同的隨機排列堿基順序的寡聚核苷酸為引物,對所研究的基因組DNA進行PCR擴增。

（2）擴增片段長度多態性

是由Vos發明的一種DNA分子標記技術,是一種選擇性地擴增限制性片段的方法,結合了RFLP的穩定性和RAPD的靈敏性。在進行AFLP實驗時,先用核酸內切酶酶解基因DNA,再將接頭接到限制性片段的兩端,形成帶有接頭的特異性片段,然后用專用引物擴增這個特異性的片段。

（3）微衛星DNA標記

進行微衛星分子標記時,首先要構建基因組文庫,根據要得到的微衛星的序列類型,設計合成寡核苷酸探針,微衛星序列的獲取主要通過重組克隆菌落原位雜交以及鑒定陽性克??；后通過鑒別微衛星序列的轉移性而合成相關的細胞引物,以待分析的核DNA為模板進行PCR；最后對擴增后的產物進行檢測,可通過放射自顯影和銀染法來檢測擴增產物。

（4）簡單序列重復區間

是近年來在物種的遺傳多樣性與遺傳結構、物種形成和種質鑒定等研究領域廣泛應用的分子標記技術,該技術直接對其基因組進行多態性分析,沒有種屬限制,不需要DNA 探針,不受環境和生長發育階段的影響,不存在表達與否的問題,具有簡便快速、準確、多態性高、穩定性好等特點。

（5）單核苷酸多態性

單核苷酸的多態性實在基因組DNA研究的基礎上,分析特定核苷酸誘發DNA序列變異的多態性,其中核苷酸轉換、顛倒、插入或缺失是常見的DNA序列變異,其中至少有一種等位基因在群體中的突變頻率不小于1%。SNP只有兩種類型,即雙等位基因。所以,在對已知突變位點檢測時只需對SNP進行兩種不同類型堿基的確認分析即可,不必對DNA片段進行全序列測定,有利于發展自動化檢測。SNP具有在個體中的多態信息量比SSR標記的多、分布廣和穩定遺傳等特點。

3.2.4.3 以DNA直接測序技術為核心的分子標記

就是直接檢測基因組DNA的核苷酸排列順序,因此可以直觀地反映遺傳的本質。DNA序列分析一般只適用于對較小的DNA片段或基因進行比較分析?？衫肞CR技術先直接從總的DNA中擴增出大量的目的DNA片段或目的基因,再對其進行測序,進而分析其遺傳多樣性。

3.3 線粒體DNA

線粒體是真核細胞內為細胞活動提供能量的重要細胞器,是正常生理狀態下細胞內氧化磷酸化的重要場所。線粒體DNA作為細胞內核外唯一存在的遺傳物質,與核DNA相比,具有分子量小、結構簡單、母系遺傳、進化速度快、無組織特異性等特點,是一個相對獨立的復制單位。線粒體基因組是研究DNA結構與復制的比較好的模型,也是研究真核細胞蛋白質合成合適的模型系統。

3.3.1 動物線粒體DNA概述

3.3.1.1 動物線粒體DNA的結構特征

動物線粒體DNA是共價閉合的環狀雙鏈超螺旋分子,外圈是它的重鏈（H）,內圈為輕鏈（L）。

3.3.1.2動物線粒體DNA的遺傳特點

（1）無組織特異性（2）母系遺傳（3）進化速度快

3.3.2 動物線粒體DNA的多態性研究

線粒體DNA的多態性是指不同群體間或群體內,線粒體DNA表現出的位點變異和序列長度變異。不同種、群間,群體內以及個體內, 線粒體DNA的一級結構都不完全相同,其存在種間及種內多態性,線粒體DNA的這個特性已被廣泛地運用。

3.3.2.1 動物線粒體DNA多態性的研究方法

3.3.2.1.1 測序法

是一種無需提取線粒體DNA的檢測手段,按常規方法提取基因組DNA,設計引物對目的DNA片斷擴增、純化,進行序列測定,比較不同物種或個體間的相關序列,以探求它們之間的進化關系,這種方法可獲得大量直接、可靠的數據,但受技術條件和經費限制,不適合大群體和大樣本的遺傳和進化研究。

3.3.2.1.2 限制性長度多態性分析法

指利用限制性內切酶圖譜進行序列的間接比較的方法。它檢測的是線粒體DNA的隨機序列,其優點是快速、經濟,具有一定的精確度,尤其適用于大群體、大樣本的遺傳進化研究。另外,PCR技術的應用可大大減少樣品的用量線粒體DNA。線粒體DNA多態分析獲得的數據經處理都可轉換成序列分歧度或遺傳距離,便于進行結果分析。這也是線粒體DNA多態性研究中使用最多的方法。

3.3.2.2動物線粒體DNA多態性研究領域3.3.2.2.1動物線粒體DNA的種間多態性

研究表明線粒體DNA的限制性圖譜具有一定的種族特征。動物研究中牛與豬的線粒體DNA經限制酶消化,可分別產生3個或2個限制性片段,而牛、山羊和綿羊均屬于洞角科動物,但目前動物研究顯示5種限制性酶之間幾乎沒有相同的限制性圖譜,并且在各種酶切割位點數相同的情況下,限制性片段也存在較大的差異。

3.3.2.2.2動物線粒體DNA的種內多態性

目前在海洋生物、爬行類動物以及兩棲類動物中已發現線粒體DNA具有多態性,并且在長度上易發生明顯的突變如六線鞭尾晰中一個種群的線粒體DNA比另一個種群的長1200個堿基對,弓鰭魚的線粒體DNA大小差異在16000-16900個堿基對之間。

3.3.2.2.3個體內線粒體DNA的多態性

有關研究表明動物單體缺乏線粒體DNA的雜合性,并且單一個體器官組織均可獲取相同的限制性圖譜。雖然偶然狀態下可檢出線粒體DNA雜合性,但這與雜合的細胞質以及不同組織線粒體DNA的突變密切相關,這類線粒體DNA多態性的研究在動物實驗以及人體研究已證實。

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R-1

A

1674-2060（2016）03-0297-02

安徽省高校省級自然科學研究項目（KJ2013B329）