劉麗清,李美艷,王愛武△
1 山東中醫藥大學,山東 濟南 250000;2 山東大學附屬省立醫院;3 山東宏濟堂制藥集團有限公司
綿茵陳中綠原酸的提取工藝及純化工藝優選
劉麗清1,2,李美艷3,王愛武3△
1 山東中醫藥大學,山東 濟南 250000;2 山東大學附屬省立醫院;3 山東宏濟堂制藥集團有限公司
目的:優選綿茵陳的提取工藝及純化工藝。方法:以綠原酸含量為指標,采用高效液相色譜法測定綠原酸含量,以加水量、提取時間、提取次數為考察因素,采用正交實驗法優選綿茵陳的提取工藝;采用不同乙醇濃度沉淀綿茵陳水提取液中綠原酸的含量。結果:最佳提取工藝為用12倍量水提取3次,1 h/次;最佳純化工藝為70%乙醇沉淀綿茵陳水提液中綠原酸。結論:最佳提取工藝對綿茵陳中綠原酸有較高提取率,水提醇沉純化綿茵陳中綠原酸的含量采用70%乙醇。
綿茵陳;綠原酸;提取工藝;純化工藝
綿茵陳為菊科植物濱蒿Artemisia scoparia Waldst.et Kit.或茵陳蒿Artemisiacapillaris Thunb.的干燥地上部分,是臨床常用中藥之一。其味苦、辛,微寒,歸脾、胃、肝、膽經,具有清利濕熱、利膽退黃之功效[1],臨床主要應用于治療黃疸、膽囊炎、肝內膽汁淤積癥、陰道炎、濕熱型濕疹等病癥[2-3]。綠原酸是其主要活性成分之一。本研究采用傳統水提取法優化綿茵陳的提取工藝,水提醇沉法優化其純化工藝[4-5],以期為綿茵陳中綠原酸的獲得提供一種最經濟、穩定的提取純化工藝。
1.2 試藥試驗中茵陳藥材購于山東省立醫院藥劑科中草藥房,經本院藥劑科王愛武主任藥師鑒定,符合2010年版《中國藥典》相關項下要求;綠原酸對照品購于中國食品藥品檢定研究院(批號:110753-201415);乙腈、磷酸為色譜純;水為重蒸水;其他試劑均為分析純。
2.1 含量測定
2.1.1 色譜條件 按2010年版《中國藥典》茵陳藥材項下方法,HPLC測定茵陳藥材及各樣品中綠原酸的含量。色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相為乙睛-0.05%磷酸溶液(10:90);流速1 mL/min;檢測波長327 nm;柱溫35 ℃;進樣量20 μL。
2.1.2 線性關系考察 精密稱取綠原酸對照品適量,置棕色瓶中,用50%甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,配成濃度為0.44 mg/mL的儲備液。分別精密吸取儲備液溶液0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mL置10 mL容量瓶中,加50%甲醇稀釋至刻度,搖勻,按“2.1.1”項下色譜條件進樣,記錄峰面積;以對照品峰面積為縱坐標,對照品質量濃度為橫坐標,得回歸方程Y=22 290 X+17 724(r=0.999 3),結果表明綠原酸在4.4~39.6 μg/mL范圍內呈良好的線性關系。
2.2 提取工藝優選
2.2.1 正交實驗設計 根據綿茵陳中主要成分綠原酸的化學性質,選用經濟的水提取。對提取工藝條件進行正交篩選實驗,篩選條件包括加水量、提取時間、提取次數,以綠原酸含量為測定指標采用L9(34)正交實驗,見表1。
表1 綿茵陳正交實驗因素水平
2.2.2 樣品的制備 根據表1正交實驗因素水平設計實驗,準確稱取茵陳藥材9份,每份50 g,水提取,提取液合并,濾過,濾液減壓濃縮,得干膏,研細備用。
優點:優秀的顯示效果及操控布局,配備光學防抖系統的等效28-140mm鏡頭。缺點:較為一般的畫質表現。
2.2.3 供試品的制備 取干膏粉末約0.3 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入50%甲醇補足減失的重量,搖勻,離心,精密量取上清液5 mL,置25 mL棕色瓶中,加50%甲醇至刻度,搖勻,濾過,取續濾液,即得供試品溶液。按照“2.1.1”項下色譜條件進樣測定,見表2—3。
表2 綿茵陳優選正交實驗安排
表3 綿茵陳正交實驗方差分析
由直觀分析可知,3個因素對提取工藝的影響順序為C>A>B。方差分析結果表明C因素對提取工藝結果有顯著性影響,其他因素則無顯著性差異。綜合考慮確定最佳提取工藝為A3B1C3,即用12倍量水提取3次,1 h/次。
2.2.4 驗證實驗 準確稱取茵陳藥材3份,每份50 g,按照上述優選提取工藝進行3次驗證實驗,結果顯示驗證結果與實驗結果基本一致,見表4。
表4 綿茵陳提取驗證結果
2.3 純化工藝優選
2.3.1 樣品制備 取茵陳2 500 g,加12倍量水提取3次,1 h/次,過濾,濾液濃縮至300 mL清膏,均分為5份,分別加入95%乙醇36.4、55.6、85.7、140、266.7 mL,使藥液含乙醇濃度分別為40%、50%、60%、70%、80%,靜置24小時,過濾,回收乙醇,減壓濃縮得干膏,研細備用。按照“2.2.3”項制備供試品溶液,按照“2.1.1”項下色譜條件進樣測定。
2.3.2 沉淀產物和干膏得率測定 取上述過濾所得沉淀,置干燥至恒重的蒸發皿中,于105℃干燥3小時至恒重后取出,置干燥器中冷卻30分鐘后稱重,40%、50%、60%、70%、80%乙醇沉淀物分別為32.84、45.27、55.27、64.18、68.66 mg/g生藥。取上述干膏適量,相當于原藥材10 g,按照沉淀產物測定方法計算干膏得率,結果見圖1、表5。
圖1 綿茵陳水提醇沉結果
表5 綿茵陳水提醇沉結果
由圖1、表5可知,水提醇沉結果隨著乙醇濃度的增加,綠原酸轉移率也增加,但到80%乙醇時和70%乙醇基本趨于平衡,考慮實際經濟因素,選擇70%乙醇沉淀為精制茵陳綠原酸的有效方法。2.3.3 驗證實驗 準確稱取茵陳藥材3份,每份50 g,按照上述優選提取工藝和純化工藝進行3次驗證實驗,結果顯示驗證結果與實驗結果基本一致,見表6。
表6 綿茵陳提取驗證結果
綠原酸是含有羥基和鄰苯二酚的有機酸,可溶于水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯和丙酮等溶劑,為優選最經濟實用的提取純化工藝,本實驗采用水提取綿茵陳中綠原酸的含量,以醇沉法純化水提取液。結果表明水提醇沉法精制綿茵陳中綠原酸的效果較好。
通過正交實驗分析可知,影響綿茵陳綠原酸提取率因素的程度由大到小依次為:提取次數、加水量、提取時間。通過方差分析,實驗確定的水提取最佳工藝參數為:用12倍量水提取3次,1 h/次。通過不同乙醇濃度精制茵陳水提液中綠原酸的含量,最佳純化工藝為70%乙醇沉淀,綠原酸轉移率為78.94%。
[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:一部[M].北京:中國醫藥科技出版社,2010:223-224.
[2] 孫遠南,馮健.茵陳蒿的化學成分與藥理作用研究進展[J].中國現代醫生,2011,49(21):12-14.
[3] 董巖,王新芳,崔長軍,等.茵陳蒿的化學成分和藥理作用研究進展[J].時珍國醫國藥,2008,19(4):874-876.
[4] 徐建國,田呈瑞,胡青平,等.綿菌陳中綠原酸的提取工藝研究[J].中國農學通報,2007,23(9):162-165.
[5] 雷昌,夏新華,黃瑪莎,等.二種純化工藝對茵陳水提液的影響研究[J].中成藥,2013,35(12):2626-2630.
文后參考文獻著錄格式示例(一)
連續出版物(期刊,含外文期刊)
[序號]主要責任者(作者為3位以下全部著錄,3位以上著錄前3位,后加“,等”).文獻題名[文獻類型標志].刊名,年,卷(期):起頁-止頁.
示例:
1)期刊分卷
[1] 羅侃,羅暢,剡雄.從循證醫學與中醫辨證論治談中西醫結合的前景[J].中國中西醫結合急救雜志,
2002,9(6):311-313.
[2] Guilbert TW,Norgan WJ,Zeiger RS,et al.Long-term inhaled corticosteroids in preschool
children at high risk for asthma[J]. N Engl J Med,2006,354(19):1985-1997.
2)期刊不分卷
[3] Turan I,Wredmark T,Fellander-Tsai L. Arthroscopic ankle arthrodesis in rheumatoid arthritis[J].Clin Orthop,1995(320):110-114.
3)期刊無卷和期
[4] Browell DA,Lennard TW.Imunologic status of the cancer patients and the effects of blood transfusion on antitumor responses[J].Curr Opin Gen Surg,1993:325-333.
Optimization of Extraction Process and Purification Process of Chlorogenic Acid from MianYinChen
LIU Liqing1,2,LI Meiyan3,WANG Aiwu3△
1 Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Jinan 250000,China;
2 Provincial Hospital Affiliated to Shandong University;
3 Shandong HongJitang Pharmaceutical Group CO.LTD
A
1004-6852(2016)11-0018-03
2015-09-27
劉麗清(1989—),女,在讀碩士研究生。研究方向:醫院新制劑開發及臨床藥學。
△通訊作者:王愛武(1966—),女,主任藥師。研究方向:醫院新制劑開發及臨床藥學。