Notch3在乳腺組織中的表達以及與乳腺癌癌變進展的關系

杜小明　花本林　李玉聰　李怡曉　曹玉文

摘要：目的 檢測乳腺組織中Notch3的蛋白表達水平，以及分析其與乳腺癌患者臨床病理參數的關系。方法 應用免疫組織化學染色方法檢測了Notch3在癌旁正常乳腺組織和乳腺浸潤性導管癌中的表達水平，并且運用統計方法進一步分析了Notch3表達水平和乳腺癌患者臨床病理參數的關系。結果 Notch3的蛋白水平在乳腺癌組織中顯著高于癌旁正常乳腺組織，P=0.000；Notch3的蛋白高表達和乳腺癌患者淋巴結轉移呈正相關，P=0.000，在TNM各分期中差異明顯，和更高的分期呈正相關，P=0.004；在病理學分級中差異明顯，和更高的分級呈正相關，P=0.035。結論 Notch3的高表達可能存進乳腺癌的癌變和進展。

關鍵詞：Notch3；Notch信號通路；乳腺癌

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，也是威脅女性健康的主要原因之一，雖然隨著診斷及先進治療手段的普及，乳腺癌的預后已經較之前有了很大提升，但是乳腺癌整體的防治還亟需繼續探尋[1]。而近年來，研究乳腺癌的分子診斷標記物和分子靶向治療成為一個重點趨勢。

Notch3是Notch受體家族中的一員，其位于19q12 染色體上，由 33 個外顯子組成，編碼1個由2321個氨基酸組成的跨膜蛋白受體，和家族其它成員相似，也是由胞外區、跨膜區和胞內區三部分組成，在和Notch家族配體結合后，激活Notch信號通路，進而發揮調控細胞生長發育、增殖和凋亡以及維持干細胞的作用[2]。進來研究發現包括Notch3在內的Notch信號通路的激活以及其活性分子的活化可以促進肝細胞癌[3]、結腸癌[4]和卵巢癌[5]等腫瘤的發生及進展，特別是Hu C和Chen CF發現在乳腺癌小鼠模型和細胞株中，Notch3的過表達可以促進乳腺癌的發生和進展[6-7]。于是本課題組設想在乳腺癌人組織中驗證上述發現。

1資料與方法

1.1一般資料 收集2006年～2014年石河子大學醫學院第一附屬醫院病理科被診斷為乳腺浸潤性導管癌（IDC）的石蠟包埋組織標本，共計90例，均為女性，年齡30～72歲，中位年齡55歲，平均年齡50歲，同時收集對照癌旁正常乳腺組織30例。所有樣本均由本科室2名高年資病理學醫師對HE染色切片進行組織學觀察和復查診斷，并進行分型、分級，其中TNM分期，0～Ⅰ期20例，Ⅱ期35例，Ⅲ期35例；病理學分級，高分化（Ⅰ級）乳腺癌13例，中分化（Ⅱ級）乳腺癌50例，低分化（Ⅲ級）乳腺癌27例。

1.2試劑 中性福爾馬林固定液、乙醇、二甲苯、枸櫞酸鹽、Z中性樹膠、DAB顯色液、H2O2均為國產產品。EnVision試劑盒購自于丹麥Dako公司，Notch3抗體購自abcam公司，克隆號為ab60087，抗體來源兔抗人，稀釋濃度為1：200。

1.3免疫組化染色 免疫組化采用Envision法。將烤好的切片依次輕放入二甲苯I、II、III中；然后將脫蠟后的切片按順序浸入裝有梯度乙醇溶液的液缸中；采用微波修復方法，將修復完的切片浸入新配制的3%甲醇雙氧水溶液中，室溫放置10min，然后用自來水沖洗1～2次；每張切片滴加已稀釋至最佳工作濃度的一抗各160μl，放入4℃冰箱過夜，孵育；將過夜后的切片從4℃冰箱取出，室溫放置10min；每張切片均滴加二抗各160μl，放入37℃恒溫箱，孵育30min；每張切片滴加1～2滴新配制的DAB顯色液，顯微鏡下觀察組織顯色情況；顯色完成后迅速用自來水沖洗，放入蘇木素中復染2.5min，鹽酸酒精分化4～6s，然后自來水中返藍3min；切片再次脫水、透明，中性樹膠封片。

1.4免疫組化結果評定 Notch3染色后出現細胞漿和/胞膜出現黃色或棕黃色顆粒為陽性細胞，隨機選取10個高倍視野（×400），每個高倍視野計數100個細胞，參照許良中[8]等的方法， 再結合本實驗室的評定標準，將切片中陽性細胞所占觀察細胞數的百分比≤10%計1分，11%～50%計2分，51%～75%計3分，76%～100%計4分；著色強度無著色計0分，淡黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分，由兩項積分相加進行評分；0～5分評為陰性表達（-），>6分評為陽性表達（+）。

1.5統計學分析 應用SPSS 17. 0軟件進行統計學分析，計數資料采用四格表或列聯表χ2檢驗法，以α=0.05雙側檢驗為檢驗顯著性水準，P<0.05表示差別有統計學意義。

2 結果

2.1 Notch3蛋白在癌旁正常乳腺和乳腺浸潤性導管癌的表達

結果如圖1所示，Notch3蛋白表達定位于乳腺癌癌細胞的細胞漿和細胞膜，染色顏色多為棕黃色和棕褐色，陽性細胞所占百分比多為>51%；而在癌旁正常乳腺組織中多無著色或淡黃色，陽性細胞所占百分比多<51%。統計數據結果見表1所示，Notch3蛋白在乳腺浸潤性導管癌（IDC）和癌旁正常乳腺組織（ANBT）中陽性表達率分別為52.3%（47/90）和6.7%（2/30），采用χ2 檢驗比較顯示，二者表達差異有統計學意義（P=0.000）。

圖 1 Notch3蛋白在乳腺浸潤性導管癌（IDC）和癌旁正常乳腺（ANBT）的表達（EnVision×200 1：200）

2.2 Notch3蛋白表達與乳腺癌患者臨床病理參數的關系 結果如表2所示，在淋巴結轉移陰性（-）和陽性（+）的患者中，Notch3蛋白表達率分別為18%（5/28）和68%（42/62），差異有統計學意義（P=0.000）；在0-I、II和III期的患者中，Notch3蛋白表達率分別為25%（5/28）、49%（17/35）和71%（25/35），差異有統計學意義（P=0.004）；在I、II和III級的患者中，Notch3蛋白表達率分別為23%（3/13）、52%（26/50）和67%（18/27），差異有統計學意義（P=0.035）。

3 討論

Notch信號通路的激活與乳腺癌的發生發展有著密切的聯系，Notch 通路中有5種Notch 配體，包括Jagged1、Jagged2、Delta1、Delta3和Delta4，4種受體，包括Notch1、Notch2、Notch3和Notch4。本實驗組前期研究結果表明，Notch信號通路分子中的Notch1蛋白[9]、N1IC蛋白[10]和Snail蛋白[11]高表達分別與乳腺癌變、侵襲轉移呈正相關，說明三者可能促進乳腺癌的發生、發展過程。課題組前期也在乳腺組織中檢測了Notch1、N1IC及Snail蛋白表達，得出結論與文獻結果一致。而除了Notch1，Notch3也被報道其高表達可能導致乳腺癌的發生[6-7]，并且預示著乳腺癌患者有著不佳的預后[12]，而這一些列促乳腺癌癌變的過程可能與Her-2、ER通路有關，抑制 Notch3信號通路可能是靶向治療乳腺癌的一個新的方向[13]。

本次實驗結果表明，Notch3蛋白在乳腺浸潤性導管癌組織中明顯高于癌旁正常乳腺組織，闡明高Notch3表達可能促進乳腺癌的癌變，這也和前期在小鼠和乳腺癌細胞株中Notch3的研究相符[6-7]，Notch3信號通路的異常參與了乳腺癌的癌變進展。接著我們在分析Notch3表達和乳腺癌患者臨床病理特征的關系時發現，Notch3的高表達和乳腺癌患者的淋巴結轉移、更高的TNM分期和較差的分化分級呈正相關，提示Notch3的高表達和更差預后及惡性程度更高的乳腺癌聯系緊密，而且可能促進了乳腺癌的浸潤轉移。而且近期有研究揭示，Notch3的高表達和結腸癌的淋巴結轉移以及更高的臨床分期呈正相關，在低分化卵巢癌、淋巴結轉移和血行轉移的卵巢癌中Notch3更易發現高表達。這些和我們的發現都進一步提示我們，Notch3可能參與促進乳腺癌的癌變和進展，Notch3表達水平有可能作為預測癌癥侵襲轉移的重要指標和對預后判斷具有一定價值。

當然，本次實驗仍存在著種種不足之處。首先，更多的樣本量需要被添加在今后的進一步研究中，其次，在乳腺組織中除了檢測Notch3蛋白水平外，我們還可以在用RT-PCR方法檢測Notch3的mRNA水平，最后，當前估算患者預后較精確的有總生存率和無病生存率，我們可以隨訪實驗納入的乳腺癌患者的生存資料，進行進一步的生存分析。本次實驗結果給予我們后續研究提供了一個基礎，也為Notch3可能作為一個潛在的乳腺癌診斷分子標記物和靶向治療藥物提供了初步的實驗依據。

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