安石榴苷減輕大強度訓練造成的骨骼肌損傷：抑制氧化損傷和線粒體動態重構的關鍵效應 

李許生??

摘 要：目的：大強度或過度訓練可造成疲勞和骨骼肌損傷，但其內在機理尚不明確。安石榴苷（石榴皮多酚的主要組分）被證實具有多種藥理學功效，如抗氧化、抗病毒、抗炎等，但PUN對運動性疲勞/損傷的影響尚無相關報道。通過建立大強度訓練模型，觀察運動造成的細胞損傷、線粒體重塑及PUN介導的保護作用。方法：60只SD雄性大鼠隨機分成4組：正常組（CON），正常加安石榴苷組（CON+ PUN），大強度訓練組（HET）及訓練加安石榴苷組（HET+PUN），15只/組。PUN為含量40%的石榴汁（150 mg/kg/d）。訓練方案：1 h/d；5 d/w（周一至周五），運動干預持續8 w。結果：大強度訓練可造成SD大鼠的運動能力降低，骨骼肌萎縮標志蛋白Atrogin-1和MuRF1水平升高，自噬水平和線粒體裂解增多；同時，HET還可造成線粒體生物合成及氧化磷酸化（Complex I & III）水平降低及氧化應激損傷。相對地，安石榴苷可有效提高動物運動水平、降低大強度訓練造成的骨骼肌損傷，有效維持線粒體網絡化及降低自噬。結論：大強度訓練引起SD大鼠的運動能力降低及骨骼肌損傷可能與其造成的氧化損傷有關，后者通過負性調節線粒體動力學重塑，如降低增殖，提高自噬等；安石榴苷能夠有效對抗大強度訓練造成骨骼肌萎縮。其中，提高骨骼肌抗氧化酶，抑制線粒體網格化重塑是其減輕骨骼肌損傷的內在關鍵機制。

關鍵詞：大強度訓練；骨骼??；骨骼肌損傷；肌肉萎縮；自吞噬；線粒體網絡；氧化應激

中圖分類號：G804.6 文獻標識碼：A 文章編號：1006-2076（2016）02-0071-08

深入了解運動對機體作用的分子機制對于維持個體健康及提高運動競技水平具有重要意義。作為運動執行和完成單位，骨骼肌與運動能力關系密切。其中，骨骼肌纖維面積和肌纖維功能是維持運動能力的關鍵因素，而骨骼肌萎縮常被認為是肌纖維面積減少或肌纖維功能降低。研究證實肌萎縮與多種疾病密切相關，如運動缺乏[1]、肥胖[2]及糖尿病[3]等。骨骼肌能夠對運動刺激產生不同應答性重塑[4-5]。然而，大強度/過度訓練造成肌萎縮的研究則相對較少。最近Masiero等研究顯示，自噬參與骨骼肌萎縮的發生進程，指出自噬水平升高是造成細胞膜及胞內蛋白和/或細胞器降解加速的內在因素[6]。此外，線粒體動力學網格化重塑也被證實是觸發骨骼肌自噬的另一關鍵調節因素[7]。線粒體不僅是能量產生的細胞器，也是細胞內多種生理過程/信號通路的調節原件，如凋亡、自噬等過程；其分裂效應增強或功能紊亂可觸發（通過線粒體或細胞自噬而實現）骨骼肌萎縮[8]。因此，抑制線粒體網絡化的病理性改變是對抗骨骼肌萎縮的有效策略之一。

有規律運動可增加骨骼肌線粒體數目，提高運動能力及有氧代謝水平[9]。運動產生的活性氧（ROS）參與調節多條細胞信號通路及多種氧化應激敏感性轉錄因子[10]。低水平ROS對于骨骼肌正常工作是必要的，但ROS水平異常升高可引起骨骼肌收縮功能紊亂（蛋白降解增加），造成運動疲勞或骨骼肌損傷[11]。因此，減低氧化應激損傷是對抗運動引起的肌肉萎縮的又一有效途徑。

安石榴苷（Punicalagin；PUN）是一種可水解單寧，呈棕黃色，主要存在于石榴皮中。PUN溶于水和其他有機溶劑，具有抗氧化、抗病毒、抗炎等多種藥理學功效[12]。PUN可通過清除過氧化氫自由基實現鏈終止反應來體現抗脂質過氧化活性，通過對自由基的清除和金屬離子的螯合實現其抗氧化作用[13]。另外，新近研究指出PUN能夠通過激活磷脂酰肌醇（-3）激酶（PI3K）-蛋白激酶B（Akt）信號通路激活血紅素加氧酶（HO-1）表達水平。提示，PUN還可激活胞漿抗氧化酶系統[14]。然而，PUN如何影響（大強度訓練后）骨骼肌線粒體動力學蛋白及胞漿抗氧化系統，目前仍鮮有報道。

3 討論

機體對運動的適應性改變依賴于運動的類型，強度，時間和頻度[18]。其中，運動強度是核心因素。本研究結果證實，長期大強度運動可造成骨骼肌萎縮及運動能力降低；同時，研究還進一步揭示氧化應激損傷和線粒體病理性重塑可能是造成該不利事件的內在機制。PUN可有效激活抗氧化酶系統（線粒體和細胞漿），抑制線粒體病理性重構，減輕骨骼肌損傷，提高大鼠運動能力。

3.1 HET觸發自噬事件及PUN抗自噬機制

運動和自噬關系的研究最早可追溯到1984年，研究發現，在透射電鏡下可以觀察到力竭運動造成自噬小體的大量形成[20]。然而，此后自噬與骨骼肌關系的研究卻一直被忽視。近年來，運動與自噬關系成為一個新的研究熱點。研究顯示低強度阻抗訓練、單次耐力性訓練及阻抗訓練能夠增加健康個體的自噬標志蛋白表達[21-22]；急性阻抗訓練可抑制志愿者自噬標志蛋白LC3B-I向LC3B-II的轉換，降低GABARAP mRNA水平[23]。以上研究表明，急性阻抗訓練可有效抑制自噬事件的發生。此外，不同運動模式對自噬的影響也存在差異：離心運動能夠引起MuRF1表達持續下降，而向心訓練能夠引起MuRF1的急速升高[24]。提示，運動對健康個體自噬影響作用存在差異，這可能與運動時間、強度的差異有關。另外，運動與自噬關系的研究還集中在代謝類疾病上，如：糖尿病[25]、肥胖[26]，胰島素抵抗[27]等，且證實運動均能對不同生理、病理條件下的實驗對象產生保護作用。然而，大強度訓練或過度訓練対自噬影響的研究還鮮有報道。本研究結果顯示，HET可造成骨骼肌自噬水平升高（圖1B），引起訓練動物運動能力下降（圖1A）。提示，HET對實驗大鼠骨骼肌造成損傷而非發揮保護效應。與之前研究結果相比，HET造成的骨骼肌損傷是自噬水平異常升高（過度自噬）的終末事件。盡管自噬的機制目前尚不清楚，但有4條信號通路明確參與對自噬信號的調節，即：FoxO3a依賴性通路、線粒體自噬、PI3K-Akt-雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路和P38分裂原激活的蛋白激酶（MAPK）[28-29]。HET造成過度自噬（盡管自噬標準尚未確立）的機制可能是：1）失活PI3K-Akt-mTOR信號通路，激活FoxO3a依賴性通路觸發凋亡事件；2）上調P38MAPK磷酸化水平；3）誘發線粒體自噬。

近年來，PUN以其眾多的生物學功能，如抗炎，解毒，抗氧化等治療作用而受到廣泛關注[12， 30-31]。盡管其生物學作用尚未完全清楚，但PUN的抗氧化作用已取得廣泛共識。本研究中發現，PUN可有效降低HET造成的骨骼肌萎縮，抑制自噬和線粒體病理性重塑作用，提高線粒體內抗氧化水平（圖1、2、3）。最近，Cao等研究指出PUN可激活AMP依賴的蛋白激酶（AMPK）-PGC-1α信號通路提高線粒體生物合成/氧化磷酸化水平，抑制線粒體動力學蛋白重塑，改善肥胖引起的心肌功能和能量代謝異常；同時，該研究還證實AMPK-PGC-1α能夠激活核呼吸因子2（Nrf2），促進二相抗氧化酶的蛋白表達水平，并指出PUN對氧化應激防御系統的激活作用是其實現心臟功能改善的核心機制[12]。另有研究指出，PUN可通過PI3K/Akt激活該信號通路（二相酶合成的上游調節機制之一）提高胞漿抗氧化水平[14]。雖然，本研究中我們沒有對該信號軸進行檢測，但從運動方式上看，HET接近過度訓練強度（可導致PI3K-AKt通路失活），PUN可能是通過激活該信號級聯而提高骨骼肌抗氧化酶系。綜上，PUN對自噬的影響可能涉及到多條信號通路/蛋白。其中，對骨骼肌抗氧化系統的激活（下調FoxO3a表達）作用可能是其抑制異常自噬的關鍵機制。

3.2 HET引起的線粒體重塑作用及PUN的保護作用

線粒體是高度動態化細胞器，其可改變形態或網格化以適應細胞內能量需求變化。多種疾病均伴隨有線粒體網絡化病理性重塑，如心肌梗死[32]、肥胖[33]、代謝綜合癥[34]等，導致線粒體氧化磷酸化水平降低，誘導線粒體介導的細胞凋亡、自噬異常等病理改變。運動（有氧或耐力）訓練可有效抑制該病理性過程[35]。運動產生保護作用主要是提高線粒體生物合成關鍵調節蛋白PGC-1α，后者可直接調控Nrf1/2促進線粒體生物合成水平，還可啟動Mfn1/2的轉錄過程，抑制DRP1表達[35]。除了運動與疾病關系的研究外，運動對正常個體線粒體影響的研究也有報道。Ding等指出單次力竭運動可抑制線粒體合成，增強分裂[36]。此外，Ding和Cartoni等均證實耐力訓練引起Mfn1、Mfn2和Fis1 mRNA明顯增加[36-37]。本研究結果顯示HET可造成線粒體分裂增多，融合降低（圖3、4）。這可能與其下調PGC-1α蛋白有關。PGC-1α受多種信號蛋白的調節，HET如何影響PGC-1α的上游蛋白或信號通路，仍需更多研究來證實。PUN對線粒體的動力學蛋白影響的研究近年來才陸續展開。研究結果表明，PUN能夠有效促進線粒體增殖，維持動力學蛋白平衡，提高線粒體功能[12， 14， 38-39]。在本研究中，圖3、4結果顯示PUN能夠明顯抑制HET造成的融合降低和裂解增多，這也部分回答了其對線粒體功能的恢復作用及對自噬的抑制效應。

綜上所述，HET引起的氧化損傷和線粒體病理性重塑是造成骨骼肌損傷及運動能力下降的關鍵因素。PUN減輕骨骼肌損傷可能與其抑制氧化損傷及線粒體動態重構效應相關。

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