5%TNBS與乙醇不同劑量配伍優化大鼠UC模型的探索*

賈雪燕　李　舒　張　紅　杜曉泉

陜西中醫藥大學(咸陽712046)

?

5%TNBS與乙醇不同劑量配伍優化大鼠UC模型的探索*

賈雪燕李舒張紅杜曉泉△

陜西中醫藥大學(咸陽712046)

摘要目的：對比5%TNBS與不同濃度無水乙醇聯合液誘導大鼠UC模型的差異，優化大鼠潰瘍性結腸炎的造模方法。方法：40只雌性SD大鼠， 隨機分為8組，包括1個正常組和7個模型組(n=5)。濃度分別為：模型1組：(5%TNBS 0.25mL+無水乙醇0.25mL)；模型2組：(5%TNBS 0.2mL+無水乙醇0.2mL)；模型3組：(5%TNBS 0.07mL+無水乙醇0.15mL+純水0.8mL)；模型4組：( 5%TNBS0.3mL+無水乙醇0.2mL)；模型5組：(5%TNBS0.07mL+無水乙醇0.12mL+純水0.11mL)；模型6組：( 5%TNBS 0.1mL+80%乙醇0.1mL)；模型7組：( 5%TNBS0.09mL+無水乙醇0.06mL)。采用不同配比的混合液對各組大鼠分別進行灌腸，觀察各組大鼠的死亡率以及體重的變化。造模10d后取距離肛門8cm處結腸組織進行病理切片。結果：與正常組比較，模型組各組均出現黑便癥狀以及結腸潰瘍的病理改變，模型1、2、3組10的死亡率為100%，模型4組20%，模型5組為80%，模型6組為60%，造模7組沒有死亡現象。結論：采用5%TNBS聯合乙醇復制大鼠UC模型的最佳配置比例為：5%TNBS 0.09mL和無水乙醇0.06mL。

主題詞結腸炎，潰瘍性/中西醫結合療法動物實驗大鼠

潰瘍性結腸炎是一種發病機制尚未闡明的慢性、復發性的炎癥性腸病。據流行病學顯示近20年UC的發病率與人們的生活水平呈正相關且逐年增高，發病年齡范圍也越來越廣泛。據統計，亞洲的發病率為1.0/10萬～2.0/10萬，患病率為4.0/10萬～44.3/10萬，中國UC患病率為11.6/10萬，因此，規范UC的治療，降低UC的發病率，是當前醫務工作者的重要任務[1]。大量臨床病歷研究顯示，中醫藥治療UC有顯著療效，在一定程度上大大降低了UC的患病率和復發率。在中醫藥治療UC的機理和療效研究中，動物模型的建立是研究結果真實準確的基礎。目前，關于UC的造模動物有SD大鼠、Wistar大鼠、C57小鼠等[2]。造模方法主要有化學誘導模型、免疫法等，如2，4，6—三硝基苯磺酸(TNBS)法、乙酸灌腸、DSS葡聚糖硫酸鈉等[3]。其中通過TNBS造模來探討UC患者活動期癥狀，研究藥物對潰瘍性結腸炎患者的治療作用及機制，為治療潰瘍性結腸炎奠定了理論基礎[4]。對于TNBS造模時造模劑的配置劑量，有報道研究，不同劑量的TNBS，對造出潰瘍性結腸炎大鼠模型的影響不同[5]，也認識到把握好麻醉及TNBS/乙醇混合液的劑量是降低死亡率，建立持續而穩定的大鼠慢性潰瘍性結腸炎模型的關鍵[6]。迄今關于TNBS/乙醇混合液的最佳配置劑量研究未見報道。本論文通過采用5%TNBS誘導大鼠腸損傷制作潰瘍性結腸炎的模型實驗，觀察大鼠病情變化及腸粘膜的病理變化，旨在尋找5%TNBS與乙醇的最佳造模配置比。

1材料與方法

1.1研究動物清潔級SD雄性大鼠40只(西安交通大學醫學院實驗動物中心，合格證號：SYXK(陜)2012-003)，體重(180-220g)。

1.2實驗器材5%TNBS(美國sigma公司，批號： P2297)，無水乙醇(西安化學試劑廠，批號：130618)，水合氯醛(上海山浦化學有限公司)，生理鹽水(石家莊四藥有限公司)，一次性使用兒童導尿硅膠管(揚州市桂龍醫療器械有限公司)，固體石蠟(德州默霖消毒科技有限公司)，一次性1mL注射器，PBS，10%甲醛(成都市科龍化工有限公司)。

1.3造模方法除正常組外，模型組參考Karaca[7-8]制備方法采用TNBS誘導的動物模型，將40只SD雌性大鼠隨機分成七組，造模組35只，具體濃度和劑量參照表1，正常組5只，僅灌注0.5mL生理鹽水。造模前大鼠須禁食不禁水12h，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.3mL/100g)，在固體石蠟潤滑下，用改良后的一次性兒童硅膠導尿管，導入距離肛門約8cm的結腸，導入造模液0.15mL。注意：導入造模液時取頭低尾高位，并倒置40s，保證造模液與結腸充分接觸，然后將大鼠頭低尾高30度體位放置于墊料中5min。造模完后，調整室溫至27℃～30℃，直至大鼠自然蘇醒。

表1　UC造模濃度和劑量

1.4觀察大鼠體重、進食、糞便情況、記錄死亡數量分別于大鼠造模前及處死前稱量大鼠體重，在造模完成后觀察大鼠的體重，進食情況以及有無粘液膿血便的狀況。記錄各組動物死亡的情況，計算第10天的死亡率。

1.5大鼠結腸組織病理切片HE染色觀察將大鼠麻醉，取距離肛門8cm處結腸組織，經PBS清洗后迅速將其投入包埋框，并用10%甲醛固定，浸泡12h，然后進行石蠟組織包埋，切片(厚度為3um)，并HE染色，觀察大鼠結腸的變化。

2結果

2.1一般情況實驗組大鼠造模后從第一天開始都有活動減少，食欲下降，精神萎靡，便血等癥狀。兩天后出現黑便，大便形狀成扁橢圓形，持續至取材當天。正常對照組食欲正常，大便無明顯變化，造模后進食水稍多。

2.2大鼠造模前后體重的比較造模前大鼠平均體重為236.6g，造模后大鼠平均體重為274.7g，比較造模前后的體重有所增加，經T檢驗比較，有顯著性差異，P<0.0001。

2.3各組大鼠死亡率的變化七組造模大鼠造模后陸續開始有死亡現象，10天之內，如表2所示，模型1、2、3組10的死亡率為100%，模型4組20%，模型5組為80%，模型6組為60%，造模7組沒有死亡現象。解剖死亡大鼠，發現大部分造模組大鼠死亡原因為腸梗阻所致。見表2。

表2　造模后大鼠死亡率的比較

2.4各組結腸組織的病理學變化正常組大鼠結腸表面光滑血管清晰，內壁絨毛整齊規律，可見杯狀細胞，無出血和潰瘍面。造模1組腸道內壁表面絨毛消失，大量炎性細胞浸潤，潰瘍深入到肌層。造模2組可見腸道內壁絨毛刷狀緣大面積消失，有大量的空泡細胞，黏膜及粘膜下層變薄。造模3組清晰可見黏膜和黏膜下層大量炎性細胞浸潤，刷狀緣部分消失，部分可見。造模4組可見整齊刷狀緣，有少量小潰瘍，基底部有少量出血。造模5組明顯可見有出血，少量潰瘍，刷狀緣整齊可見空泡細胞。造模6組腸黏膜隱窩處有小膿腫形成，黏膜及黏膜下層可見中性粒細胞、淋巴細胞、漿細胞及嗜酸性粒細胞浸潤，繼而有廣泛潰瘍形成。潰瘍底部有時可見急性血管炎，血管壁成纖維素樣壞死。造模7組可見明顯小潰瘍面，腸粘膜隱窩處有小膿腫，黏膜下層可見大量炎性細胞浸潤。見圖1。

3討論

潰瘍性結腸炎確切的發病機制尚不明確，需要加強研究。關于潰瘍性結腸炎發病機制和實驗治療學的研究主要依賴于動物模型，成功復制潰瘍性結腸炎動物模型是開展UC發病機制和中西藥防治UC 的關鍵。常見的動物模型有C57小鼠，SD大鼠等。TNBS灌腸所復制的動物模型與人類UC病變特點相似，是研究藥物治療效用與機制較好的模型，但是，目前使用TNBS誘導大鼠潰瘍性結腸炎的濃度以及與無水乙醇的比例存在多種方案，尚無確切數值，造模的成功率不夠穩定。研究發現，造模劑的濃度是制約模型成功的關鍵因素，因此，急需探索TNBS與無水乙醇聯合的合適比例，優化大鼠潰瘍性結腸炎的造模方法。本實驗摸索出采用TNBS結合乙醇造模的最佳實驗條件：濃度比例為5%TNBS 0.09mL與無水乙醇0.06mL，實驗室溫度必須保持在27℃～30℃以保證大鼠的體溫，麻醉劑量為10%水合氯醛0.3mL/100g。此種造模比例最為經濟有效，周期短，方法簡單，是研究潰瘍性結腸炎發病機制和有關中醫藥療效觀察的理想模型。

圖1　七組造模大鼠與正常組大鼠結腸組織HE染色的比較(×100)

綜合我們的實驗結果，提示 采用5%TNBS結合乙醇造UC大鼠模型的最佳配置比例為：5%TNBS 0.09mL和無水乙醇0.06mL。這種比例造出的潰瘍性結腸炎模型不僅有黑便、腹瀉、精神倦怠等潰瘍性結腸炎的癥狀，而且死亡率小，病理組織切片也符合潰瘍性結腸炎的表現，值得應用。

參考文獻

[1]陳治水，陳寧．潰瘍性結腸炎中西醫結合研究新進展 [J]．中國中西醫結合雜志，2012，32(4)：437-442．

[2]李茹柳，遲莉，郭文峰，等．造模因素對TNBS致大鼠潰瘍性結腸炎模型的影響[J] ．中藥藥理與臨床，2007，23(6)：81-83．

[3]孫載鑫，李欣，武喜?。甎C模型大鼠造模方法建立和探討[J] ．齊齊哈爾醫學院學報，2015，36(12)：1717-1719．

[4]吳小庚，王愛磊，張學明，等.實驗性潰瘍性結腸炎大鼠模型的建立 [J] ．河北醫藥，2011，33(4)：493-495．

[5]張冰冰，齊越，賈冬，等。2，4，6-三硝基苯磺酸誘導潰瘍性結腸大鼠模型的建立及評價[J].中華中醫藥學刊，2015，33(8)：835-836.

[6]惠毅，閆曙光，李京濤，等．大鼠慢性潰瘍性結腸炎模型建立方法探討[J] ．遼寧中醫藥大學學報，2013，15(10)：62-65．

[7]Karaca T， Uz Y H， Demirtas S， et al. Protective effect of royal jelly in 2， 4， 6 trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis in rats[J]. Iranian Journal of Basic Medical Sciences， 2015， 18(4)： 370.

[8]Yoon S W， Lee C H， Kim J Y， et al. Lactobacillus casei secreting alpha-MSH induces the therapeutic effect on DSS-induced acute colitis in Balb/c Mice[J]. Journal of microbiology and biotechnology， 2008， 18(12)： 1975-1983.

(收稿2016-001-12；修回2016-02-23)

5% TNBS coordinate with different doses of ethanol to optimize the model of UC in rats

ShaanxiUniversity of Chinese Medicine(Xianyang712046)

Jia XueyanLi ShuZhang Honget al

ABSTRACTObjective： To compare the difference of 5% TNBS joint different concentrations of ethanol to induce UC model in rats，and optimize the methods inducing UC. Methods:40 female SD rats were randomly divided into eight groups， including a control group and seven model group (n=5). The ethanol concentrations were shown as following： Model 1 group： (5% TNBS 0.25mL+ ethanol 0.25mL); model 2 groups： (5% TNBS 0.2mL + ethanol 0.2mL); Model 3 groups： (5% TNBS 0.07mL + dry Ethanol 0.15mL + water 0.8mL); Model 4 group with 0.3mL 5% TNBS and 0.2mL ethanol， model 5 groups with 0.07mL 5% TNBS and pure water and ethanol 0.11mL 0.12mL， model six groups with 0.1mL5 % TNBS and 80% ethanol 0.1mL， model 7 groups with 0.09mL5% TNBS and ethanol 0.06mL. A mixture of different proportions of each group were lavaged. After modeling 10d， mortality and changes in body weight of the rats were observed. and colon tissue at 8 cm from the anus were taken for morphology. Results： Compared with normal group， melena symptoms and pathological changes of the colon ulcers were found in each model group.l Mortality were 100% in No. 1，2，3 groups ，20% in No. 4 group， 80% in No. 5 group and 60% in No. 6 group， but no mortality in No. 7 groups. Conclusion： The optimal allocation of TNBS and ethanol for rat model of UC is 5% TNBS 0.09mL and ethanol 0.06mL.

KEY WORDSColitis，Ulcerative/Traditional Chinese medicine therapyAnimal ExperimentationRats

通訊作者△

【中圖分類號】R574.1

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7369.2016.07.081

*陜西省科學技術研究發展計劃 (2013K12-01-20)