脂多糖對體外培養的人冠狀動脈平滑肌細胞生長的影響
——對建立支架內再狹窄炎癥細胞模型的探索

李紅梅，王顯

脂多糖對體外培養的人冠狀動脈平滑肌細胞生長的影響
——對建立支架內再狹窄炎癥細胞模型的探索

李紅梅1，2，王顯1，2

目的 探討不同濃度脂多糖（LPS）作用不同時間對體外培養的人冠狀動脈平滑肌細胞（HCASMC）生長的影響，分析其應用于HCASMC的無毒性反應濃度范圍，為開展介入術后再狹窄相關研究建立HCASMC炎癥活化模型提供實驗數據支持。方法 體外培養的HCASMC 3～5代，加入96孔細胞培養板，用噻唑藍比色實驗（MTT法）檢測不同濃度（0 μg/ml，0.01 μg/ml，0.1 μg/ml，0.5 μg/ml，1 μg/ml，5 μg/ml，10 μg/ml，100 μg/ml）LPS在不同作用時間（24 h，46 h，72 h）下對HCASMC活力影響，酶標儀492 nm處測定各組A值，細胞活力=（實驗組A值-調零孔A值）/對照組A值。結果 LPS在低于100 μg/ml濃度范圍內，干預HCASMC時間短于48 h未出現細胞毒性，多表現為促細胞增殖效應，而干預時間大于48 h則顯現出較為明顯的細胞毒性，且細胞活力隨LPS濃度的增大而減低；干預72 h后LPS濃度在0～0.01μg/ml范圍內有促增殖作用，0.1～0.5μg/ml濃度則產生輕微的細胞抑制作用，但細胞毒性不明顯，在1～100 μg/ml濃度下HCASMC毒性反應逐漸出現，且HCASMC活力隨LPS濃度的升高而減低。同一濃度水平的LPS隨著作用時間延長，HCASMC的細胞活力逐步下降，且作用時間越長下降越明顯。結論LPS在濃度0.1 μg/ml以下未出現明顯的細胞毒性，其中LPS濃度0.01 μg/ml干預24 h，人冠狀動脈平滑肌細胞增殖最顯著，可作為建立炎癥誘導人冠狀動脈平滑肌細胞活化模型的最佳條件。

脂多糖；人冠狀動脈平滑肌細胞；細胞活力；細胞毒性

經皮冠狀動脈介入治療（PCI）是動脈粥樣硬化性心血管疾病治療史上的一大突破，然而介入術后3個月內仍有10%～20%的再狹窄率，部分甚至并未降低主要不良心血管事件的發生［1，2］。目前國內外十分關注支架內再狹窄和支架血栓與炎癥因子之間的密切關系，公認血管內膜增生是動脈血管對各種損傷的一種反應，也是PCI術后再狹窄的重要標志［3，4］。人冠狀動脈平滑肌細胞（HCASMC）被各種損傷刺激激活后，由靜息狀態轉變為增殖表型并移行到內膜下，參與合成各種細胞外基質，在內膜增生過程中具有重要作用。越來越多的證據表明各種組織損傷能夠通過誘導先天免疫反應，促進動脈壁的炎癥，進而激活HCASMC加劇血管內膜增生。炎癥誘導活化的HCASMC在介入術后再狹窄形成中起關鍵作用，針對HCASMC進行炎癥相關實驗研究成為明確再狹窄核心機制的切入點。

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）也被稱為內毒素，是革蘭陰性細菌細胞壁的主要組成成分之一，作為具有高度保守結構的病原相關分子模式，在細胞內信號轉導中充當Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）信號轉導分子配體，可刺激HCASMC分泌多種炎癥細胞因子、趨化因子、基質金屬蛋白酶等，適合用于炎癥狀態下HCASMC功能的研究。由于建立HCASMC炎癥狀態下活化模型是再狹窄機制研究的基礎，本實驗選用不同濃度LPS作用不同時間于體外培養的HCASMC，觀察不同條件下LPS對體外培養的HCASMC生長和增殖的影響，探索建立炎癥刺激HCASMC活化模型的LPS最佳濃度和作用時間，以期為利用LPS研究HCASMC炎癥增殖所致介入術后再狹窄機制提供實驗數據支持。

1 材料和方法

1.1主要材料

1.1.1試劑 HCASMC（貨號：FC-0031）、平滑肌細胞培養基、胰酶、胰酶抑制劑、凍存液均購自美國Life line公司；磷酸鹽緩沖液、噻唑蘭（MTT）粉末250 mg、二甲基亞礬（DMSO）瓶裝100 ml，均購自北京索萊寶科技有限公司；脂多糖10 mg/ml（貨號：L8880-10），購自Sigma （L2880）。

1.1.2儀器 超凈工作臺CJT-E-Ⅱ（北京昌平長城空氣凈化工程公司）、倒置相差顯微鏡（Olympus CKX×41）、低速離心機LD4-2（北京雷勃爾離心機有限公司）、培養箱MCO-20AIC（SANYO Elecronic.Ltd.JAPEN）、-80℃低溫冰箱（美國REVCO Legaci）、電熱恒溫水箱（HH.W21.420）、全自動酶標儀（Clinicbio 128C）、十萬分之一精密電子分析天平（日本島津AEC-45SM）。

1.2方法

1.2.1人冠狀動脈平滑肌細胞的體外培養 將保存于液氮罐中的細胞取出后立刻放到干冰上，將管子浸入37℃水浴中，待細胞懸液融化后將細胞接種于培養瓶，并放入培養箱中（37℃，5%CO2）培養，次日更換培養基。之后2～3 d傳代一次，實驗選用3～5代細胞。

1.2.2實驗分組 實驗時設置調零孔、對照孔（5個復孔）、LPS孔（每組6個復孔）。調零孔不加細胞，對照孔加細胞但培養基不加LPS，LPS孔加細胞和溶解有不同濃度LPS的培養基（0.01 μg/ml組，0.1 μg/ml組，0.5 μg/ml組，1 μg/ml組，5 μg/ml組，10 μg/ml組和100 μg/ml組）。

1.2.3接種細胞 當細胞數占整個瓶底70%～80%時，將細胞消化計數后調整細胞密度為8×104個/mL，接種于三塊96孔板（調零孔加100μl無細胞培養基），100μl/孔，邊緣孔加入150μl PBS液填充，然后置于37℃、5%CO2培養箱中培養，次日加不同濃度LPS。

1.2.4LPS干預措施 加LPS 次日取出三塊96孔板以無菌PBS沖洗2遍，調零孔和對照組每孔加入100μl正常培養基，LPS組每孔加入對應等體積濃度的LPS溶液，置于37℃、5%CO2培養箱中孵育。其中96孔板一用LPS刺激24 h，96孔板二用LPS刺激48 h，96孔板三用LPS刺激72 h。

1.2.5檢測細胞抑制率 96孔板達到各自LPS刺激時間后每孔加入20μl 0.5 mg/ml的對應MTT培養基溶液，然后置于37℃、5%CO2培養箱繼續培養4 h后，吸棄上清，每孔加150μl DMSO振蕩10 min，待結晶全部溶解后于酶標儀492 nm處測各孔A值，并計算不同濃度LPS刺激不同時間對HCASMC生長的影響。細胞活力=（實驗組A值-調零孔A值）/對照組A值。

1.3統計學處理 用SPSS 17.0統計軟件進行數據處理，計量資料采用均數±標準差（±s）表示，組間均數比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1細胞培養 通過倒置相差顯微鏡觀察，剛復蘇的HCASMC漂浮于培養基中呈未貼壁狀態，細胞縮為圓形，單個或成團存在，體積較小。培養6 h后大部分細胞貼壁，24 h后細胞貼壁完全。貼壁的HCASMC變為梭形生長，伸展性好，透明度好，3 d后進入對數生長期并相互重疊生長，呈致密束狀排列（圖1，圖2）。

2.2不同濃度LPS作用24 h對HCASMC生長及增殖的影響 倒置顯微鏡鏡下觀察，剛種入96孔板的HCASMC體積較小，為圓形，非貼壁漂浮于培養基中，2 h后逐漸貼壁變為梭形生長，加入不同濃度LPS前各孔細胞已進入對數生長期并鋪滿孔底80%。不同濃度LPS作用24 h后均對HCASMC產生促增殖作用，各LPS孔細胞數量增多，密度較對照組偏大。

圖1　倒置相差顯微鏡下HCASMC （40×）

圖2　倒置相差顯微鏡下HCASMC （100×）

統計學結果顯示：與對照組相比，低中濃度（0.01 μg/ml、0.1 μg/ml、1 μg/ml及5 μg/ml）LPS對HCASMC有明顯促增殖作用，差異有統計學意義（P均＜0.05）。各濃度LPS都能增強細胞活力，其中0.01 μg/ml組LPS促增殖能力最明顯，細胞活力最強。但各組促增殖作用并未體現出濃度依賴性（表1，圖3）。

表1　不同濃度LPS作用24 h對HCASMC生長的影響

圖3　不同濃度LPS作用不同時間對HCASMC生長的影響

2.3不同濃度LPS作用48 h對HCASMC生長及增殖的影響 倒置顯微鏡鏡下觀察，加入不同濃度LPS前各孔細胞已進入對數生長期并鋪滿孔底80%。不同濃度LPS作用48 h后均對HCASMC產生促增殖作用，各LPS孔細胞數量增多，密度增大，與作用24 h相比促細胞增殖能力稍有下降。

統計學結果顯示：與對照組相比，不同濃度LPS對HCASMC增殖無明顯影響，差異無統計學意義（P均＞0.05）。但不同濃度LPS都對HCASMC活力有增強作用，其中0.01 μg/ml濃度的LPS促增殖能力最強。LPS孵育48 h促增殖作用無濃度依賴性（表2，圖3）。

2.4不同濃度LPS作用72h對HCASMC生長及增

殖的影響 倒置顯微鏡鏡下觀察，0.01μg/ml組 LPS作用72 h后HCASMC細胞數量增多，密度較對照組偏大，1～100μg/ml濃度組各孔細胞縮小變圓，部分細胞脫落漂浮于培養基中，細胞透明度降低，舒縮性較差，其余LPS濃度孔細胞與對照組相比未見顯著改變。

統計學結果顯示：與對照組相比，100μg/ml 組LPS作用72 h后對HCASMC增殖的抑制作用明顯，差異有統計學意義（P＜0.05），顯現明顯的細胞毒性。LPS濃度在0～0.01 μg/ml范圍內有促增殖作用，0.1～0.5 μg/ml濃度產生輕微的細胞抑制作用，但細胞毒性不明顯，在1～100 μg/ml濃度下HCASMC毒性反應逐漸出現，且HCASMC活力隨LPS濃度的升高而減低（表3，圖3）。

2.5不同濃度LPS不同作用時間對HCASMC細胞活力的影響對比 各濃度組作用24 h后細胞活力升高，作用48 h后輕度升高，而作用72 h后細胞活力下降。同一濃度水平的LPS隨著作用時間延長，HCASMC的細胞活力逐步下降，且作用時間越長下降越明顯（表4，圖4）。

3 討論

動脈粥樣硬化性心血管疾病引發的急性心血管事件是嚴重危害人類生命健康的頭號殺手，經導管支架植入術成為目前治療的有效途徑，然而支架術后有10%～20%再狹窄率以及延遲性支架血栓形成風險成為介入領域廣泛關注的熱點和難點。通常認為，支架內再狹窄是局部血管對損傷的一種反應，支架術后血管重塑與炎癥、平滑肌細胞增殖和凋亡、內皮功能損害、血栓形成等密切相關［5］，血管平滑肌細胞表型轉換、增殖和遷移是常見血管病變的共同病理基礎［6，7］。研究表明，在炎癥細胞浸潤和血小板聚集的共同作用下，大量細胞因子和生長因子釋放，激活血管中層平滑肌細胞，促進平滑肌細胞表型轉換、增殖和遷移，并合成大量細胞外基質，導致血管內膜增厚和管腔狹窄［8-10］。

表2　不同濃度LPS作用48h對HCASMC生長的影響

表3　不同濃度LPS作用72h對HCASMC生長的影響

表4　不同濃度LPS作用不同時間對HCASMC細胞活力的影響

圖4　不同濃度LPS作用不同時間對HCASMC活力的影響

模式識別受體是一種經過廣泛選擇的種系編碼受體，它們通過分子模式來感知侵入機體的危險信號，與其它免疫組分一起構成了機體的第一道防線［11，12］，其中Toll樣受體（toll 1ike receptors，TLRs）是研究較多的參與炎癥反應且與先天免疫有關的模式識別受體家族。TLRs（包括TLR2和TLR4）能識別病原體，在病原體入侵機體的早期即可啟動先天免疫，TLR4介導的髓樣分化蛋白MyD88（myeloid differentiation protein 88，MyD88）信號轉導通路在抗感染中發揮重要作用［11］。近年來研究發現，TLR4能識別組織細胞損傷后釋放的內源性配基和一些危險信號，從而介導炎癥性反應和細胞增殖與分化等［4，12］。TLR4被激活后引起自身的二聚化與MyD88結合，MyD88通過其死域與白細胞介素-1受體相關激酶（IL-1 receptor-associated kinase，IRAK）結合，導致IRAK的自身磷酸化，從而激活腫瘤壞死因子受體相關因子-6（tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6），促使有絲分裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族活化，其中核轉錄因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）誘導激酶激活I-κB家族α、β激酶，導致I-κB磷酸化而降解，使NF-κB移位到細胞核，啟動TNF-α、IL-1、IL-6等炎癥細胞因子的轉錄，這些炎癥介質參與血管損傷反應，在HCASMC增殖、分化和凋亡的過程中起到重要的調節作用［12-14］。由此可見，成功建立TLRs-MyD88炎癥激活狀態下的HCASMC模型作為支架內再狹窄的研究載體將成為下一步研究的核心所在，而LPS作為TLRs-MyD88炎癥信號通路的直接激活劑，成為本實驗干預研究的主要制劑。

LPS是炎癥相關研究的常用藥物。體外培養的HCASMC識別革蘭氏陰性細菌細胞壁成分LPS并釋放多種細胞因子、趨化因子，促進動脈粥樣斑塊的形成。Toll-4受體作為LPS的主要受體，參與LPS信號的跨膜轉導。TLR4轉導通路中的信號蛋白及下游轉錄因子在數量、結構和功能上發生改變，可引起炎癥因子釋放、抗炎因子產生減少，并導致特定信號通路的激活［15］，因此合理應用這一藥物是后續建立HCASMC炎癥細胞模型成敗的關鍵。

MTT法［16-18］是一種檢測細胞存活和生長的方法，其檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為不溶于水的藍紫色結晶甲瓚并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜能溶解細胞中的甲瓚，用酶標儀在490 nm波長處測定其吸光度值，可間接反映活細胞數量，在一定細胞數范圍內，MTT結晶形成的量與細胞數成正比。因本方法具有靈敏度高、經濟實用的特點，故本研究選擇MTT法作為檢測LPS刺激細胞生長增殖情況的基本方法。

本研究發現，LPS不同濃度和不同作用時間對體外培養的HCASMC細胞生長有著直接影響。LPS＜100μg/ml時，干預HCASMC時間小于48 h未出現明顯細胞毒性，而干預時間大于48 h則顯現出較為明顯的細胞毒性，且細胞活力隨LPS濃度的增大而減低；干預72 h后LPS濃度在0～0.01 μg/ml范圍內有促增殖作用，0.01～1 μg/ml濃度產生輕微的細胞抑制作用，但細胞毒性不明顯，在1～100 μg/ml濃度下HCASMC毒性反應逐漸出現。同一濃度水平的LPS作用下則隨著時間延長，HCASMC的細胞活力逐步下降，且作用時間越長下降越明顯。

由此可以推測，LPS在濃度1 μg/ml以下不會引起細胞毒性，0.01 μg/ml干預24 h條件下可最大程度刺激HCASMC增殖，可作為建立炎癥誘導HCASMC活化模型的最佳條件。但本研究也存在一些不足，首先本研究是基于離體水平的實驗探索，在體水平的研究有待進一步完善。其次，本研究只初步觀察了LPS對HCASMC生長增殖的影響，摸索出的條件僅能夠簡單反映炎癥條件下的HCASMC增殖狀態，然而此條件下能否同時對細胞內TLRs-MyD88炎癥信號通路產生最大程度的激活作用還需完善后續實驗進行證實和摸索。

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本文編輯：姚雪莉

Influence of lipopolysaccharide on growth of in vitro human coronary artery smooth muscle cells: an investigation on establishing in-stent restenosis inflammatory cell model

LI Hong-Mei*， WANG Xian.*Dongzhimen Hospital， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100700， China.

WANG Xian， E-mail: wx650515@163.com

Objective To investigate the influence of lipopolysaccharide （LPS） in different doses on growth of in vitro human coronary artery smooth muscle cells （HCASMC） at different times， analyze non-toxic concentration range of LPS to HCASMC， and provide test data for establishing HCASMC inflammation activation model in studies related to restenosis after interventional therapy. Methods HCASMC was cultured in vitro for 3-5 generations， and seeded onto 96-well plates. The influences of LPS in different doses （0 μg/mL， 0.01 μg/mL， 0.1 μg/mL， 0.5 μg/ mL， 1 μg/mL， 5 μg/mL， 10 μg/mL and 100 μg/mL） on viability of HCASMC at different time points （24 h，46 h，72 h） were detected by using MTT assay. The value A was detected by using ELISA at point of 492 nm， and cell viability=（value A of test group- value A of zero hole）/value A of control group. Results When LPS dose was lower than 100 μg/mL and interventional time was shorter than 48 h， there was no cytotoxicity observed to HCASMC and there was promotion effect on proliferation. When interventional time was longer than 48 h， there was significant cytotoxicity observed and viability of HCASMC would decrease as LPS dose increased. After intervention for 72 h，LPS had promotion effect on proliferation in doses from 0 μg/mL to 0.01 μg/mL， and mild inhibitory effect in doses from 0.1 μg/mL to 0.5 μg/mL but cytotoxicity was not significant. The toxic reaction gradually appeared when LPS dose was from 1 μg/mL to 100 μg/mL， and viability of HCASMC decreased as LPS dose increased. When LPS doses were the same， viability of HCASMC gradually decreased as interventional time was prolonged， and the longer the interventional time was， the more significant the decrease of HCASMC was. Conclusion LPS had no significant cytotoxicity when its dose is 0.1 μg/mL， and when its dose is 0.01 μg/mL， the proliferation of HCASMC will be more significant after intervention for 24 h， which can be taken as the best condition for establishing HCASMC inflammation activation model.

Lipopolysaccharide； Human coronary artery smooth muscle cells； Cell viability； Cytotoxicity

R543.3

A

1674-4055（2016）01-0029-05

國家自然科學基金面上項目（81273913）；北京中醫藥大學重點學科開放課題（2013-ZDXKKF-27）
1100700 北京，北京中醫藥大學東直門醫院；2100700北京，北京中醫藥大學心血管病研究所

10.3969/j.issn.1674-4055.2016.01.07

王顯，E-mail:wx650515@163.com