血管緊張素Ⅱ在缺氧誘導的人肺成纖維細胞表型轉化及膠原合成中的作用

劉珊珊　王浩彥　周秀梅

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·基礎研究·

血管緊張素Ⅱ在缺氧誘導的人肺成纖維細胞表型轉化及膠原合成中的作用

劉珊珊王浩彥周秀梅

目的：探討血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)在缺氧誘導的人肺成纖維細胞(human lung fibroblast，HLF)表型轉化及膠原合成中的作用。方法：在缺氧條件下培養HLF-1細胞株，將細胞分為AngⅡ組、AngⅡ+替米沙坦(TST)組和對照組。采用免疫熒光法檢測HLF-1細胞α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的表達水平；采用Western blot法檢測HLF-1細胞Ⅰ型膠原(collagen typeⅠ，Col-Ⅰ)蛋白的表達水平。結果：AngⅡ組HLF-1細胞α-SMA和Col-Ⅰ蛋白的表達水平較對照組明顯上調，AngⅡ+TST組α-SMA和Col-Ⅰ蛋白的表達水平較AngⅡ組明顯下降。結論：AngⅡ/血管緊張素Ⅱ1型受體信號通路可誘導缺氧性HLF表型轉化以及膠原合成。

血管緊張素Ⅱ；血管緊張素Ⅱ1型受體；缺氧；人肺成纖維細胞；表型轉化；Ⅰ型膠原蛋白

缺氧性肺動脈高壓是肺動脈高壓的常見類型，其發病機制目前尚未完全闡明。缺氧性肺血管重構(hypoxia pulmonary vascular remodeling，HPVR)在缺氧性肺動脈高壓的形成中起關鍵作用。越來越多的證據表明，肺血管外膜成纖維細胞增殖活化、膠原纖維等細胞外基質合成增加是HPVR形成的重要環節。

成纖維細胞的主要功能是分泌膠原蛋白，是細胞外基質的主要來源細胞。血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)是腎素-血管緊張素系統(RAS)的重要效應分子。研究發現，在肺動脈高壓的發病機制中，AngⅡ作為一種細胞因子促進肺血管重構[1-2]。

本研究在體外缺氧條件下培養人肺成纖維細胞(human lung fibroblast，HLF)，觀察缺氧條件下AngⅡ及血管緊張素Ⅱ 1型受體(AT1R)對HLF表型轉化及Ⅰ型膠原(collagen type Ⅰ，Col-Ⅰ)蛋白合成的影響，初步探討缺氧條件下人肺血管外膜成纖維細胞膠原合成調控的機制。

1　材料和方法

1.1材料

HLF-1細胞株由中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心提供。小鼠抗人α-tubulin(T-6074)抗體、AngⅡ、替米沙坦(telmisartan，TST)購自Sigma-Aldrich公司。山羊抗人Col-Ⅰ蛋白抗體(sc-25974)、驢抗山羊IgG-HRP抗體(sc-2304)、山羊抗小鼠IgG-HRP抗體(sc-2302)購自Santa Cruz Biotechnology公司。Triton X-100購自福州邁新生物技術開發有限公司。Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG抗體(A11008)購自Life Technologies公司。細胞核與細胞質蛋白抽提試劑盒購自杭州碧云天生物技術研究所。

1.2方法

1.2.1HLF-1細胞的培養及分組HLF-1細胞在37℃、5%CO2的培養箱中靜置培養。當細胞生長至融合狀態時，用0.25%胰蛋白酶消化細胞，并進行傳代培養。取第3～6代細胞用于后續實驗。實驗前將培養基更換成無血清的DMEM培養基培養24 h，使細胞生長處于靜止狀態。

缺氧條件下細胞的培養過程如下：在指定時間內，將HLF-1細胞置于37℃、體積濃度93% N2、5%CO2、2%O2的培養箱中培養。在缺氧暴露開始和結束時用測氧儀監測培養箱中的氧濃度。

按實驗要求將HLF-1細胞隨機分為下列3組。(1)對照組：加入DMSO；(2)AngⅡ組：用AngⅡ(1.0 μmol/L)處理HLF-1細胞1 h；(3)AngⅡ+TST組：用AngⅡ(1.0 μmol/L)處理HLF-1細胞1 h，然后加入TST(50 μmol/L)培養1 h。

1.2.2Western blot采用細胞核與細胞質蛋白抽提試劑盒提取細胞蛋白成分。蛋白質經變性、電泳、轉膜、封閉后分別加入Col-Ⅰ抗體(1∶500)和抗α-tubulin抗體(1∶5 000)，4℃孵育過夜。洗膜后加入辣根過氧化酶(HRP)標記的二抗(1∶2 000)，室溫孵育2 h。洗膜后加入增強的化學發光試劑ECL顯色，X線膠片曝光。將膠片掃描后，測定各條帶光密度值。將目的條帶與α-tubulin光密度值的比值作為蛋白的相對表達量。

1.2.3免疫熒光法室溫下用含4%多聚甲醛的PBS溶液固定HLF-1細胞，之后用含0.1% Triton X-100的PBS液孵育細胞，Tris-HCl緩沖液沖洗 2次后加入5%山羊血清100 μL，室溫下孵育5 min。Tris-HCL緩沖液沖洗2次。加入100 μL兔抗人α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)抗體(1∶200)，4℃孵育過夜。Tris-HCL緩沖液沖洗3次后，加入100 μL Alexa Fluor 488標記的山羊抗兔IgG抗體(1∶100)，室溫下孵育30 min。沖洗后加入含有DAPI的封片劑包埋。采用Nikon TiE 2 000共聚焦熒光顯微鏡獲取圖像，并測量α-SMA蛋白的平均熒光強度值。

1.3統計學分析

采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，所有數據以均數±標準差表示。多組數據的比較采用F 方差檢驗，兩組數據的比較采用t 檢驗，以P< 0.05為有統計學差異。

2　結果

2.1α-SMA蛋白的表達

Ang Ⅱ組α-SMA蛋白的平均熒光強度明顯高于DMSO組，Ang Ⅱ+TST組α-SMA蛋白的平均熒光強度較Ang Ⅱ組明顯下降(P<0.01，見圖1、表1)。

2.2Col-Ⅰ蛋白的表達

AngⅡ組Col-Ⅰ蛋白的表達較DMSO組明顯升高；AngⅡ+TST組Col-Ⅰ蛋白的表達較AngⅡ組明顯下降(P<0.01，見圖2、表1)。

圖1　各組HLF-1細胞α-SMA蛋白的表達(×400)

圖2　各組細胞Col-Ⅰ蛋白的表達

組別α-SMACol-Ⅰ/α-tubulin對照組1.13±0.1522.21±2.25AngⅡ組3.02±0.21(1)79.63±9.07(1)AngⅡ+TST組1.71±0.41(2)30.16±5.76(2)

注：與對照組比較，(1)P<0.01；與AngⅡ組比較，(2)P<0.01

3　討論

缺氧性肺血管收縮和HPVR是缺氧性肺動脈高壓的兩大主要病理生理基礎。HPVR在缺氧性肺動脈高壓的形成中起關鍵性作用，肺血管壁細胞增殖、管壁增厚、管腔狹窄是HPVR的主要病理特征[3]。

血管外膜主要由疏松結締組織構成，成纖維細胞是血管外膜最主要的細胞成分，其主要功能是分泌膠原等細胞外基質成分。以往對HPVR的研究多集中在肺血管內皮細胞和中層平滑肌細胞，而忽略了肺血管外膜改變在HPVR中的作用。越來越多的證據表明，在低氧條件下，肺血管外膜成纖維細胞的增殖活化、表型轉化是影響HPVR形成的另一重要環節。在低氧暴露的早期，血管外膜就發生了明顯的重構變化，表現為外膜成纖維細胞的增殖活化[4]。

組織中的成纖維細胞可活化和表型轉化為肌成纖維細胞[5-6]。肌成纖維細胞是介于成纖維細胞和平滑肌細胞之間的間充質來源細胞。在低氧條件下，血管外膜成纖維細胞可轉化為肌成纖維細胞，后者在形態和功能上與肺動脈平滑肌相似，具有收縮和遷移的功能；肌成纖維細胞同時仍有成纖維細胞的功能和特性，且其合成細胞基質的能力強于成纖維細胞，是合成細胞基質、膠原的主要細胞。α-SMA是肌成纖維細胞的特征性標志蛋白，是研究成纖維細胞表型轉化為肌成纖維細胞的特異性標志物。

Ang Ⅱ是RAS重要的效應物質，循環中以及局部自分泌或旁分泌的AngⅡ主要通過與其受體結合，在不同靶組織和器官中發揮生物活性作用[7-8]。有文獻報道，血管外膜存在AngⅡ受體，經AngⅡ灌注的SD大鼠的胸主動脈血管外膜膠原蛋白沉積增多[9]。

Ang Ⅱ可促進血管成纖維細胞增生并表達Col-Ⅰ，從而促進血管結構性重構的發生[10]。Ang Ⅱ的絕大多數生物學作用都是由AT1R介導的。

本實驗體外培養HLF細胞，模擬缺氧性肺動脈高壓的慢性缺氧環境，檢測AngⅡ/AT1R信號通路對缺氧性HLF-1細胞Col-Ⅰ蛋白表達及肌成纖維細胞特征性標志物α-SMA蛋白表達的影響。結果顯示，AngⅡ可顯著促進HLF-1細胞表達α-SMA和Col-Ⅰ，加入AT1R阻滯劑TST后，HLF-1細胞α-SMA和Col-Ⅰ蛋白的表達受到顯著抑制。

由此推測，作為RAS的重要效應分子，AngⅡ通過AT1R途徑參與了缺氧性HLF細胞膠原合成的調控，并可能在肺動脈高壓血管重構的發生、發展中起重要作用。AngⅡ不僅可以直接促進缺氧性HLF-1細胞Col-Ⅰ蛋白的合成，而且可以促進HLF-1細胞向肌成纖維細胞的轉化，促進肺血管外膜結構和功能的變化，進一步導致血管壁增厚變硬、管腔狹窄和血管重構。

缺氧性HLF細胞膠原的合成過程復雜，涉及多種細胞、細胞因子及信號轉導通路。本研究未探討RAS其他組分在此過程中的作用，且本研究為體外實驗，有一定的局限性。

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(收稿：2015-12-15修回：2016-04-04)

(本文編輯：梁英超)

Effect of angiotensin Ⅱ on hypoxia-induced phenotype switch and collagen synthesis of human lung fibroblasts

LIU Shanshan1,WANG Haoyan2,ZHOU Xiumei1.

1.Department of Respiratory Medicine,Beijing Fengtai Hospital,Beijing100071; 2.Department of Respiratory Medicine,Beijing Friendship Hospital,Capital Medical University,Beijing100050,China

Objective:To explore the effect of angiotensin Ⅱ(AngⅡ) on hypoxia-induced phenotype switch and collagen synthesis of human lung fibroblasts (HLF).Methods:The HLF-1 cell line was cultured in hypoxic condition,and randomly divided into three groups:control group,AngⅡ group,and AngⅡ+ telmisartan (TST) group.The α-smooth muscle actin (α-SMA )protein expression levels were measured by immunofluorescence localization analysis.The collagen type Ⅰ (Col-Ⅰ) protein expression levels were detected by Western blot.Results:The expression levels of α-SMA and Col-Ⅰ in hypoxic HLF-1 cells were significantly increased after AngⅡ treatment and the effect was significantly inhibited by telmisartan,an angiotensin Ⅱ type 1 receptor inhibitor.Conclusion:AngⅡ/angiotensin Ⅱ type 1 receptor can induce phenotype switch and collagen synthesis in hypoxic HLF.

Angiotensin Ⅱ; Angiotensin Ⅱ type 1 receptor; Hypoxia; Human lung fibroblast; Phenotype switch; Collagen typeⅠ

100071北京豐臺醫院呼吸科(劉珊珊，周秀梅)；100050首都醫科大學附屬北京友誼醫院呼吸科(王浩彥)

劉珊珊，Email：liushanshan721cn@126.com

10.3969/j.issn.1673-6583.2016.04.011