維生素C對體外培養的H9C2心肌細胞系的影響

任晨霞　麻麗霞　郭　萍　郭　穎　曹文君

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維生素C對體外培養的H9C2心肌細胞系的影響

任晨霞麻麗霞郭萍郭穎曹文君

目的：探討維生素C對大鼠H9C2心肌細胞抗氧化能力與細胞活力的影響。方法：以體外培養的大鼠H9C2心肌細胞為研究對象，在培養過程中，分別加入不同濃度的維生素C，觀察細胞形態，MTT法檢測心肌細胞活力，DCFH-DA熒光探針法測定維生素C對H2O2處理的心肌細胞活性氧(ROS)生成的影響，用比色法檢測半胱天冬酶(caspase)-3和caspase-9活性。 結果：0.05 mg/mL維生素C處理后，H9C2心肌細胞形態發生變化，細胞質中顆粒狀物質增多，排列紊亂，間隙增寬； 0.05 mg/mL維生素C可有效抑制H2O2導致的ROS積累；但隨著培養基中維生素C濃度的升高，心肌細胞存活率明顯降低，且維生素C處理后caspase-3和caspase-9活性明顯升高。結論：H9C2心肌細胞培養中添加維生素C可產生明顯的抗氧化作用，但維生素C對H9C2心肌細胞生長具有抑制作用。

維生素C；H9C2心肌細胞；細胞活力

心肌病是由于心室結構改變和心肌受損引起心臟功能障礙的病變。研究發現，在心肌損傷區出現大量活性氧(reactive oxygen species,ROS)的積累[1]。心肌缺血再灌注過程中，大量氧自由基的產生可引起心律失常以及心肌梗死面積擴大等現象[2]。早期酒精性心肌病大鼠模型的心肌組織中，過氧化物產物丙二醛水平顯著升高，而清除氧化物和自由基的過氧化物酶體和金屬硫蛋白水平降低[3]。心肌細胞氧化應激是導致心肌功能紊亂的一個重要因素。減少ROS產生、消除心肌細胞的氧化應激可減輕心肌損傷[4-7]。因此，抗氧化藥物是心血管疾病治療中的重要部分。

維生素C(即抗壞血酸)具有多種生物學功能，是細胞中氧自由基的清除劑，參與體內氧化還原反應及羥化反應。風濕性心臟病患者血清中維生素C水平顯著高于健康人，其分子機制仍不明確[8]。本文主要探討維生素C對體外培養的H9C2心肌細胞系的影響。

1　材料與方法

1.1材料

大鼠H9C2心肌細胞系購自中國科學院上海生命科學研究院。DCFH-DA熒光探針法ROS檢測試劑盒購于江蘇碧云天生物技術研究所，半胱天冬酶(caspase)-3、caspase-9活性檢測試劑盒購于南京建成生物技術研究所；DMEM培養基和胎牛血清(FBS)購于賽默飛世爾生物化學制品(北京)有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養向細胞培養瓶中添加含10% FBS和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養基，置于5% CO2、37℃恒溫培養箱中培養。待細胞生長至70%～80%融合狀態時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，培養6～7代后進行后續實驗。

1.2.2MTT實驗取對數生長期的心肌細胞，胰蛋白酶消化后進行細胞計數，按1×104個/孔的密度接種于96孔板中，每孔200 μL細胞懸液。將96孔板放置在37℃、5% CO2條件下培養，待細胞貼壁后，換用無血清培養液200 μL/孔饑餓培養24 h，使細胞生長同步化至G0期。吸棄上清液，分別加入含不同濃度維生素C的培養液，培養至測定時間。每孔加入20 μL的5 mg/mL MTT，避光孵育4 h后終止培養，吸棄上清，每孔加入150 μL 二甲基亞砜(DMSO)，將培養板置于水平搖床上37℃輕搖10 min。采用酶標儀在490 nm波長下測定各孔吸光度值。

細胞存活率=處理組吸光度/對照組吸光度×100%

1.2.3心肌細胞內ROS水平的檢測將心肌細胞以2×105個/mL的密度接種于6孔板中，無血清培養液同步化饑餓培養24 h后，分為對照組、過氧化氫(H2O2)組(加入50 μmol/L H2O2)、H2O2+維生素C組(加入50 μmol/L H2O2和 0.05 mg/mL維生素C)、維生素C組(加入0.05 mg/mL維生素C)，分別培養24 h。用無血清DMEM按1∶1 000比例稀釋DCFH-DA探針，使其終濃度為10 μmol/L，吸棄6孔板中的培養液，每孔加入1 mL稀釋好的DCFH-DA，37℃避光孵育30 min后，用無血清DMEM培養液洗滌細胞3次。將6孔板置于熒光倒置顯微鏡下觀察細胞內的熒光強度，采集圖像。

1.2.4凋亡活性檢測采用比色法測定心肌細胞中caspase-3、caspase-9的活性。0.05 mg/mL 維生素C處理H9C2細胞24 h后，經胰蛋白酶消化收集細胞，用PBS洗滌1次后吸去上清，加入50 μL細胞裂解液，反復凍融3次后，12 000 轉/min、4℃離心15 min，吸取上清液按照試劑盒說明書進行操作，在405 nm波長下測定吸光度值。

1.3統計學分析

實驗數據以均數±標準差表示，每項實驗均獨立重復3次。采用SPSS 16.0統計軟件進行統計學分析。兩組間差異比較采用t檢驗，P<0.05 為差異有統計學意義。

2　結果

2.1心肌細胞形態

正常心肌細胞呈梭形，細胞界限清晰，排列規整；0.05 mg/mL維生素C組H9C2心肌細胞形態不規整，細胞質中顆粒狀物質增多，排列紊亂，間隙增寬(見圖1)。

注： A為對照組；B為維生素C組

2.2心肌細胞存活率

維生素C處理后24 h后心肌細胞活力顯著下降，0.05 mg/mL維生素C干預導致細胞存活率降至66.06%，隨著濃度增高細胞存活率降低至50%以下(見圖2)。在0.05 mg/mL維生素C作用下，心肌細胞存活率不隨培養時間的延長而變化(見表1)。

注：與未加維生素C組相比，(1)P<0.01

2.3維生素C的抗氧化作用

與對照組相比，H2O2組心肌細胞內ROS熒光明顯增強，而H2O2+維生素C組ROS熒光強度明顯低于H2O2組(見圖3)。

2.4caspase-3和caspase-9活性

與對照組相比，維生素C組H9C2心肌細胞內的caspase-3和caspase-9的活性均顯著上升(P<0.01，見圖4)。

表1　不同時間點 0.05 mg/mL維生素C處理對H9C2心肌細胞活力的影響

注：與對照組相比，(1)P<0.01

注： A為對照組；B為H2O2組；C為H2O2 +維生素C組；D為維生素C組

注：與對照組相比，(1)P<0.01

3　討論

心肌細胞的氧化應激狀態與心肌損傷密切相關[9]，ROS可作為信號分子激活致心肌細胞肥大或細胞凋亡的信號通路[10]。高水平ROS會破壞生物大分子、線粒體和細胞膜的結構，導致心律失?；蛐募」δ苷系K[11]。減少病理情況下細胞內氧自由基的產生，防止細胞膜損傷和脂質過氧化，對減輕或防止心功能障礙具有重要意義。

正常生理狀態下，心肌細胞通過抗氧化酶或維生素等抗氧化劑來維持ROS的低水平狀態。維生素C是一種廣泛應用的抗氧化劑，已有研究表明維生素C可有效減輕腎和骨骼肌的氧化損傷，但是其對心肌的保護作用及機制的研究較少[12-13]。本研究發現，H2O2可引起心肌細胞內產生大量ROS，而維生素C可有效抑制ROS的積累，說明維生素C在抗氧化方面具有明顯效果，能夠改善氧化應激狀態，對心血管疾病的預防和治療有一定的積極作用。

然而，正如機體內環境中的葡萄糖、脂類物質積累過多會導致細胞毒性一樣，維生素C過多積累也會產生細胞毒性。本研究發現，維生素C可降低H2O2引起的心肌細胞中ROS產生，但同時可顯著抑制心肌細胞的生長，并提高凋亡相關蛋白caspase-3和caspase-9的活性。這說明維生素C在發揮抗氧化作用之外，還存在其他信號調控通路，有待于進一步研究。

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(收稿：2016-03-03修回：2016-06-02 )

(本文編輯：梁英超)

Effect of vitamin C on cultured H9C2myocardial cells

REN Chenxia,MA Lixia,GUO Ping,GUO Ying,CAO Wenjun.

Institute of Cardiovascular Diseases,Changzhi Medical College,Shanxi046000,China

Objective:To investigate the effect of vitamin C on the antioxidant capacity and cell viability of H9C2cell lines.Methods:The cultured H9C2cells were treated with vitamin C of different concentrations,and cell morphology was observed under inverted microscope.MTT assay was used to test the cell viability.Fluorescent probe DCFH-DA was used to determinate the effect of vitamin C on the intracellular ROS induced by H2O2.The activity of caspase-3 and caspase-9 were tested by colorimetric method.Results:The morphological changes of H9C2cardiomyocyteswere observed after treatment of 0.05 mg/mL vitamin C,including the increase of granular substance in the cytoplasm,arranged disorder and widened intercellular gap.0.05 mg/mL vitamin C could inhibit the accumulation of ROS caused by H2O2,but with the increase of vitamin C concentration,the survival rate of cardiomyocytes decreased significantly and the activity of caspase-3 and caspase-9 increased significantly.Conclusion:Vitamin C has a significant antioxidant effect on the H9C2cardiomyocytes,but it can significantly inhibit the cell growth.

Vitamin C; H9C2cardiomyocytes; Cell viability

山西省基礎研究計劃項目(2015021185)；長治醫學院科技創新團隊項目(CX201507)；長治醫學院普及項目(QDZ201503)

046000長治醫學院心血管病研究所

曹文君，Email：wjcao16@hotmail.com

10.3969/j.issn.1673-6583.2016.04.012