3D 激光掃描顯微鏡下牙本質齲微結構的觀察和分析

許立俠 徐紅梅 朱曉英 孫麗梅

武警總醫院口腔科，北京 100039

3D 激光掃描顯微鏡下牙本質齲微結構的觀察和分析

許立俠 徐紅梅 朱曉英 孫麗梅

武警總醫院口腔科，北京 100039

目的 通過3D激光掃描顯微鏡觀察牙本質齲的微結構，為臨床上齲病的防治及相關研究提供形態學理論依據。方法 收集6顆新鮮拔除的有齲壞的第三磨牙，均制備成橫剖面標本，在3D激光掃描顯微鏡下進行光學、激光彩色及3D形貌圖的觀察。結果 在樣本整體結構中，光鏡下可見病變組織的輪廓，激光彩色鏡下較清晰分辨兩層牙本質病變；在微結構中，激光彩色圖下可以觀察到透明層牙本質小管部分閉合，脫礦層管周和管間牙本質數目較少，細菌侵入層管周和管間牙本質均破壞，相鄰小管融合，呈串珠樣和橢圓形病灶，壞死崩解層無正常牙本質結構。3D形貌圖下可根據顏色的不同觀察到四層結構。結論 3D激光掃描顯微鏡能夠分辨牙本質齲的兩層病變組織結構，觀察到牙本質四層結構中牙本質小管、管周、管間牙本質的不同改變，是觀察牙本質微結構的有力工具。同時牙本質齲微結構的形態對臨床上齲病的防治及相關研究具有理論指導意義。

牙本質齲； 3D激光掃描顯微鏡； 小管； 微結構

牙本質是位于釉質和牙髓之間的夾層結構，富含牙本質小管，當牙本質齲壞病變時，小管結構的改變尤為突出。研究者們根據臨床經驗和實驗方法的不同將牙本質齲壞分為不同層次。Ogushi等[1]將牙本質齲分為內外兩層：外層為細菌感染層，無機物脫礦，有機物分解，不能再礦化，臨床上應該徹底去除；內層無細菌，無機物稍微脫礦，有機物未分解，可以再礦化，臨床上可以保留。而現在多數學者[2]將牙本質齲的病變在組織學上由病損深部向表面分為透明層、脫礦層、細菌侵入層和壞死崩解層。還有的學者[3]將牙本質齲變層描述為粉色、淡粉色、透明色和基本正常。但每一層的微結構變化均不同。早期對于牙本質齲病結構的觀察是通過透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）[4]，近年來原子力顯微鏡的應用較為普遍，但這些方法均有不足。TEM觀察前需對標本脫水及真空處理會導致結構的改變，且僅能以黑白色進行觀察，不能夠反映樣本的真實結構。原子力顯微鏡雖能夠反映樣本的真實結構，但要求標本的表面光滑細致，且掃描圖貌耗時長。3D激光掃描顯微鏡作為微納米科學研究的重要工具之一，近年來在口腔生物材料的研究領域中獲得了國內外學者的青睞[5]。本文運用3D激光掃描顯微鏡對牙本質齲整體和局部微結構進行分析，為研究牙本質齲的相關實驗奠定基礎，也對臨床上牙本質淺齲的再礦化治療提供一定的形態學理論依據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料和設備

Hank’s平衡鹽溶液[6]（Hanks balanced salt solution，HBSS）：400 mg·L-1KCl、60 mg·L-1KH2PO4、8 000 mg·L-1NaCl、1 000 mg·L-1葡萄糖、90 mg·L-1Na2HPO4·7H2O、350 mg·L-1NaHCO3、140 mg·L-1CaCl2、100 mg·L-1MgSO4·7H2O和100 mg·L-1MgCl2· 6H2O；3D激光掃描顯微鏡（Keyence公司，日本）。

1.2 離體牙的收集

收集武警總醫院口腔頜面外科拔出的新鮮第三磨牙，從中挑選出6顆平滑面齲（圖1）。

圖 1 牙體切割示意圖Fig 1 The abirdged general view of tooth cutting

齲壞均為白堊色，患者年齡20～35歲，患者均知情同意并簽署同意書。去離子水下用潔牙機超聲清洗表面軟組織和牙石，沖洗干凈后置于HBSS溶液中4 ℃保存備用，2周內使用。

1.3 牙齒標本的制備

將收集的離體牙用硬組織切割機將牙體組織通過病變區域沿中線縱切，暴露出牙本質齲變橫剖面（圖1）。然后用環氧自凝樹脂包埋各牙齒并標記，拋光機及240、320、600、800、1 000號碳化硅砂紙在流水下依次磨平、拋光后，超聲下振蕩清洗5 min，沖洗吹干后在3D激光掃描顯微鏡下進行光學顯微、激光彩色及3D形貌圖的觀察比較。

2 結果

2.1 牙本質齲整體結構的形貌觀察圖

在光學顯微形貌圖中（200倍和400倍）可以觀察到病變組織由釉質齲沿釉牙本質界擴展而來的牙本質齲的大體輪廓，外層顏色較深，而內層顏色稍淡。但在1 000倍下形貌分層模糊不清。在激光彩色形貌圖中可清晰地觀察到齲壞病變分為兩層，1 000倍下分層明確，牙本質小管也清晰可見，牙本質小管大多管腔開口，散落在整個牙本質中；也有呈管束狀的牙本質小管（圖2）。

2.2 牙本質齲微結構的激光彩色圖

在3 000倍下的激光彩色圖中可以觀察到牙本質齲四層微結構的變化（圖3）。正常牙本質小管管腔清晰，管周牙本質明顯，管間牙本質結構完整（圖3a）。位于牙本質齲最深層的透明層，牙本質小管變窄，有的完全阻塞（圖3b）；透明層表面的脫礦層，牙本質小管形態較完整，管周牙本質和管間牙本質數目減少，管周可見較大的白色礦物質沉積物（圖3c）；近脫礦層的細菌侵入層，局部小管管壁膨脹，擴張變形，管周牙本質被壓迫，管間牙本質破壞，相鄰小管相互融合，呈串珠樣結構。病變進一步進展，被破壞的小管進一步融合，形成橢圓形的液化壞死灶（紅色彎曲箭頭所示）；釉牙本質界處的壞死崩解層，幾乎無正常牙本質結構，完全崩解破壞，為全黑色空隙，齲洞從釉牙本質界處形成。

2.3 牙本質齲微結構全貌3D形貌圖

1 000倍下以3D格式顯示激光彩色形貌圖，以不同顏色顯示3D圖像的色階，左側顏色條顯示與顏色對應的高度值，紅色光標（用于上限）和藍色光標（用于下限）。牙本質從釉牙本質界處到健康牙本質組織的顏色由藍色向紅色過渡，即高度由低向高過渡；釉質牙本質界處組織凹陷，以藍色居多，高度較低（圖4）。

2.4 牙本質齲微結構局部3D形貌圖

3 000倍下以3D格式顯示的激光彩色形貌圖更立體形象地顯示了各層牙本質齲變及微結構的形態變化。同樣以不同顏色顯示3D圖像的色階，紅色區域可代表正常牙本質，淡紅色和橙黃色區域可代表牙本質齲的內層即透明層和脫礦層，黃綠色區域和藍色及尖峰狀區域可代表牙本質齲的外層即細菌侵入層和壞死崩解層（圖5）。

圖 2 牙本質齲的整體結構形貌圖Fig 2 Topography of the whole structure in dentin caries lesions

圖 3 牙本質齲微結構激光彩色圖 3D激光掃描顯微鏡 × 3 000Fig 3 Laser color topography of the microstructure in dentin caries lesions 3D laser scanning microscope × 3 000

圖 4 牙本質齲全貌3D圖 3D激光掃描顯微鏡 × 1 000Fig 4 Three-dimensional observation of the whole structure in dentin caries lesions 3D laser scanning microscope × 1 000

圖 5 牙本質齲微結構局部3D形貌圖 3D激光掃描顯微鏡 × 3 000Fig 5 Three-dimensional observation of the microstructure in dentin caries lesions 3D laser scanning microscope × 3 000

3 討論

3.1 3D激光掃描顯微鏡的成像原理

3D激光掃描顯微鏡以微納米尺度對樣品三維表面形貌進行測量，測量精度可達到0.001 μm。其成像原理采用了“激光光源”和“白色光源”2路光源方式。通過這2個光源獲得構建彩色全焦點圖像、激光全焦點圖像、高低圖像所必要的色彩、光量、高度的信息。首先通過短波長激光檢測反射光量和高度。從激光顯微系統的激光光源發出的光線經由XY掃描光學系統、接物透鏡聚光至對象物體上。聚光后的點光源通過XY掃描光學系統在觀察視野內進行面掃描。在觀察視野內分割成1 024×768像素運行掃描，并由受光組件檢測各像素的反射光。將接物透鏡在Z軸方向上驅動，反復運行面掃描，獲得各像素的各Z軸位置處的反射光量。將反射光量最高的Z軸位置設為焦點，檢測高度信息和反射光量。這樣便可獲得整體對焦的光量全焦圖像和高低圖像信息。其次，使用彩色電荷耦合器件（Charge Coupled Device，簡稱CCD攝像機）檢測白光源的發射光。CCD攝像機在每個像素的基礎上，使用激光束獲取焦點位置的顏色信息。前期實驗應用3D激光顯微鏡觀察到早期釉質齲的納米結構，釉柱頭部晶體變大，釉質間隙增寬，釉柱鞘連續性中斷等顯著變化[7]。

3.2 牙本質齲微結構形態的分析

由于點隙窩溝解剖結構的復雜性，會干擾齲變的形態學研究，所以本實驗以平滑面齲為實驗對象。牙本質齲多是由釉質齲進一步向深層發展而來，部分也可由牙根部牙骨質齲發展所致。牙本質全層存在牙本質小管，齲損沿釉牙本質界擴散，同時沿牙本質小管進展，病程較快。牙本質齲中小管的改變較為突出，是研究牙本質齲病變的主要分析對象。

在整體結構中，光學顯微鏡下僅能在低倍鏡下觀察到病變組織的大體輪廓，高倍鏡下分層結構模糊不清，微結構改變更是難以辨識。而在激光彩色圖貌中，不僅低倍鏡下病變組織分層明確，高倍鏡下牙本質小管清晰可見，病變組織處的牙本質小管數目減少，釉牙本質界處齲損也很明確。

在微結構中，激光彩色形貌圖可清晰地觀察到牙本質小管、管周牙本質、管間牙本質等微結構的變化。接近正常組織的透明層牙本質小管管腔變窄，部分小管完全阻塞。而近透明層處仍可見正常牙本質小管，管周牙本質明顯，管間牙本質結構完整。透明層又稱為硬化層，是牙本質齲最早出現的改變，由于牙本質小管管腔中有礦物質沉積，使小管管腔變窄，隨著礦物質沉積增多，最終將牙本質小管管腔完全阻塞。Ogawa等[8]在顯微硬度分析中發現，此層硬度和正常牙本質相比較低，表明透明層存在一定的脫礦。本實驗觀察到管周和管間牙本質的無機物降解現象，而激光彩色（光學）形貌圖是一種在測量后用激光強度圖像和光學圖像合成的全幅對焦光學圖像，用顏色對各高度像素進行標示，由CCD相機按每1像素分別提取，再轉換成激光高分辨率圖像。牙體組織的脫礦、礦物質溶解等可能導致牙本質表面高度的改變，從而在激光彩色形貌圖中體現出顏色的改變。脫礦層中牙本質小管的形態較完整，但直徑相對變大，管周和管間牙本質數目減少，說明存在脫礦現象。有部分管周牙本質小管有白色較大礦物質沉積，表明同時存在再礦化現象[9]。而在臨床上洞型制備時是否保留此層深部質硬的牙本質一直存在爭議。Iwami等[10]研究表明脫礦層雖已脫礦軟化，但部分軟化牙本質是無菌的。Besinis等[11]研究也表明軟化牙本質可再礦化。此外，保存此層牙本質并隨后充填，即使存在一些受感染的牙本質，只要充填物保持完整，病變即不會進展。因此在脫礦層軟化牙本質深方質硬且著色的牙本質在洞型制備時不需去除。而馮希平[12]在牙體充填后繼發齲的產生和預防中總結出絕大多數充填體再次充填是因為原發性齲病，因此認為應將這些軟化牙本質徹底去除。細菌侵入層可觀察到小管管壁腫脹、擴張變形，相鄰小管相互融合，呈串珠樣外觀等破壞輕微的現象。同時可看到被破壞的小管進一步融合，形成橢圓形壞死灶等破壞較嚴重的階段。造成細菌侵入層現象的原因是由于細菌侵入，小管內細菌大量繁殖，小管壁脫礦，蛋白溶解，局部小管由于細菌團塊的增加，管壁膨脹擴張變形，管周牙本質首先被壓迫，隨后壓迫管間牙本質，隨著管周和管間牙本質的脫礦加劇，膠原纖維變性分解，管周牙本質破壞，相鄰小管融合呈串珠樣外觀。病變進一步發展，被破壞的小管持續融合，形成橢圓形的壞死灶。此層內有細菌感染，臨床上應該徹底清除。在壞死崩解層，幾乎無正常牙本質結構，釉牙本質界處齲洞形成。

透明層、脫礦層、細菌侵入層、壞死崩解層的形成是一種動態的過程，很難具體劃分界限，而3D激光掃描顯微鏡記錄一個樣品在最大光強度時每個像素的光電倍增管激光強度數據和實際高度數據（一種內置光學線性刻度值）。以不同顏色顯示3D圖像的色階，顏色色階對應相應的高度值。3D顯示時，能夠以立體鏡方式查看圖像。牙本質齲中礦物質溶解，可能會使牙本質表面高低發生改變。因此在3D形貌圖中，可以通過顏色的不同大體區分不同組織病變，而且立體形象。紅色區域可代表正常牙本質；牙本質齲的內層即透明層和脫礦層，脫礦程度較輕微，可呈現出淡紅色和橙黃色；黃綠色區域和藍色及尖峰狀區域可代表牙本質齲的外層即細菌侵入層和壞死崩解層，齲壞脫礦較嚴重。

綜上所述，本研究應用3D激光掃描顯微鏡可以觀察到牙本質齲四層牙本質小管、管周和管間牙本質等微結構的不同改變，進一步驗證了內層即透明層和脫礦層，雖有少量微結構脫礦，但存在再礦化現象，為進一步研究牙本質齲的相關實驗奠定基礎，也對臨床上牙本質淺齲的再礦化治療提供了形態學理論依據。

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（本文編輯 杜冰）

Observation and analysis of microstructure of dentin caries lesions through 3D laser scanning microscope

Xu Lixia, Xu Hongmei, Zhu Xiaoying, Sun Limei.
(Dept. of Stomatology, The General Hospital of Armed Police Force, Beijing 100039, China)

Supported by: The Second Kind Foundation of General Hospital of Armed Police Force(WZ201024). Correspondence: Xu Hongmei, E-mail: hmxu@163.com.

Objective Microstructural changes in dentin carious lesions were investigated using a 3D laser scanning microscope, which has a morphological theoretical foundation in the further study of clinical caries disease prevention and treatments. Methods Six fresh extracted caries molars were prepared into cross-section specimens. The sections were examined by 3D and laser measuring morphology. Results Zones were identified in the lesions on the basis of their optical appearance. Two zones were identified in the lesions on the basis of their laser appearance. The microstructure showed that the tubular was partly closed in transparent dentin; peritubular and intertubular dentin were reduced in the zone of demineralization; peritubular and intertubular dentin were damaged and fused; a beaded sample and oval lesions formed in the zone of bacterial invasion; and abnormal dentin structure was present in the zone of destruction on the basis of their laser appearance. Four zones were identified in the lesions according to their colors, as determined from their 3D appearance. Conclusion 3D laser scanning microscope may be a powerful, accessible, and non-destructive technique, as it identified the lesion and tubular zones, as well as peritubular and intertubular dentin in the four zones’ lesions. The microstructure of dentin caries lesions may have significant merit in the evaluation of clinical prevention and treatment.

dentin caries; 3D laser scanning microscope; tubular; microstructure

R 781.1

A [doi] 10.7518/hxkq.2016.05.017

2016-03-25；

2016-07-12

武警總醫院院內資助項目二類（WZ201024）

許立俠，住院醫師，碩士，E-mail：xulixia2007@126.com

徐紅梅，副主任醫師，碩士，E-mail：h_m_xu@163.com