鼠李糖乳桿菌的篩選與誘變
乳酸菌培養物中含有乳酸菌、多種代謝產物及變性培養基成分,可以作為一種有益的飼料添加劑。本試驗的目的就是要選育出一株抑菌活性高而廣,產酸性能強和生長繁殖速度快且穩定性好的乳酸菌菌種,以利于今后飼用微生態制劑的開發與應用?,F將試驗結果報告如下。
菌種
乳酸菌
嗜酸乳桿菌700株、糞鏈球菌48株,由本校微生物室保存;短乳桿菌(17)、嗜酸乳桿菌、糞鏈球菌(130)、胚乳桿菌(557)、德氏乳桿菌保加利亞亞種、乳酸乳球菌乳酸亞種(1690),購于中國科學院微生物研究所。
指示菌
金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌(K88)、雞白痢沙門氏菌、蠟狀芽胞桿菌、枯草芽胞桿菌、無乳鏈球菌,購于中國獸醫藥品監測所。
乳酸菌的篩選
乳酸菌的分離與鑒定
用MRS和Elliker瓊脂培養基分離鑒定。
乳酸菌的第一步篩選
用牛津杯雙層平板定量擴散法(參照何寧等(1999)介紹的方法,略加改進)篩選抑菌譜廣、抑菌圈直徑大的乳酸菌菌種(株)。
乳酸菌的第二步篩選
將產生抑菌物質的乳酸菌接種在MRS液體培養基上,37℃培養48h后,用酸度計測定乳酸菌培養物的酸堿度。
乳酸菌的第三步篩選
測抑菌物質重量。
乳酸菌紫外線誘變與篩選
參考諸葛健等 介紹的方法,稍做改進。以乳酸菌的抑菌活性、產酸能力和穩定性為檢測項目篩選正向突變菌株。
乳酸菌分離鑒定
根據分離菌的形態、染色及生化特性,可以初步鑒定為:L1、L2是植物乳桿菌;L3是鼠李糖乳桿菌;L4是短乳桿菌;L5是詹氏乳桿菌。
乳酸菌的篩選
將9種13株乳酸菌于4℃冰箱中保存三個月后活化,僅有五種菌活化成功,對其進行了抑菌活性、產酸能力及生長速度的測定。
鼠李糖乳桿菌L3株和胚乳桿菌(557)均有較強的抑菌活性和產酸能力,但前者生長繁殖速度快,菌體干重是胚乳桿菌的1.83倍,故認為鼠李糖乳桿菌L3株是理想的目的菌。
鼠李糖乳桿菌L3株的誘變與篩選
誘變致死率
用紫外線照射鼠李糖乳桿菌L3株37℃、48h的培養物,不同照射時間對其致死率結果不同。
誘變后篩選結果
用紫外線照射鼠李糖乳桿菌L3株15s后,選取100個MRS平板上的菌落進行培養液抑菌活性和pH值測定。其中正向突變的10株鼠李糖乳桿菌的抑菌圈直徑和pH值變化結果。
誘變菌株的抑菌圈直徑增加值變化較大,以L3-22株為最高,L3-50次之;而pH值下降不明顯,均不超過1%。
誘變菌株的穩定性試驗結果
將10株鼠李糖乳桿菌誘變株連續傳6代,測定培養液的抑菌圈直徑和pH值,運用EXCEL軟件統計其變異系數。鼠李糖乳桿菌L3-22株抑菌圈直徑變異系數小,故該菌株的穩定性較高。
乳酸菌的分離
用MRS 和Elliker瓊脂培養基及厭氧培養方法,從樣品中分離出4種5株乳酸菌,根據分離菌的形態、染色及生化反應特性,初步鑒定的結果是:L1、L2為植物乳桿菌;L3為鼠李糖乳桿菌;L4為短乳桿菌;L5為詹氏乳桿菌。用于分離培養的樣品較多,但分離出的乳酸菌較少,可能與乳酸菌初代分離培養較困難以及嚴氧條件要求較高有關。
乳酸菌的篩選
本試驗對9種13株乳酸菌進行了抑菌活性、抑菌范圍、產酸能力及生長繁殖速度的測定,從中篩選出鼠李糖乳桿菌L3株為理想的目的菌,其對四種革蘭氏陽性菌和兩種革蘭氏陰性菌均有較強的抑菌作用。乳酸菌素是乳酸菌在代謝過程中產生的—種多肽類物質,屬于細菌素,一般對近緣的革蘭氏陽性細菌有抑制作用[4,5]。本試驗篩選出的鼠李糖乳桿菌L3株產生的抑菌物質(主要是乳酸菌素)對革蘭氏陽性菌和陰性菌均有較強的抑菌活性,具有重要的應用價值,其作用機理和抗菌譜尚有待于進一步研究。
乳酸菌在生長繁殖過程中,可分泌以乳酸為主的酸性物質到周圍環境。鼠李糖乳桿菌L3株具有很強的產酸性能,可使培養基的酸度下降到pH值3.5以下。
乳酸菌的誘變
用紫外線照射鼠李糖乳桿菌L3株進行誘變,獲得10株正向突變菌株,考慮到突變菌株的抑菌活性的穩定性是主要因素,故將抑菌活性分別提高11.74%和8.92%的兩株突變菌作為目的菌。誘變菌株培養物的pH值下降不明顯,可能與出發菌株的產酸能力已經很高有關。
經過乳酸菌的分離鑒定、篩選、誘變和篩選的過程,從而選育出一株抑菌活性高、抑菌活性穩定、抑菌范圍廣、產酸能力強及生長速度快的鼠李糖乳桿菌,即鼠李糖乳桿菌L3-22株。
引理2 對任何EB估計δn=δn(R1,R2,…,Rn)的風險函數Rn(δn)有
其中E*表示對(r1,r2,…,rn)的聯合分布求期望。
定理2 在平方損失函數下,有替換定數截尾試驗指數分布的參數λ,如果先驗分布取Gamma 分布,參數λ的估計量是漸進最優EB估計。其中
證明:由引理2及控制收斂定理知如果
由漸進最優性的定義可得估計量δn是漸進最優EB估計。因此由控制收斂定理只需證明且即可。
10.3969/j.issn.1001- 8972.2016.21.014