洛鉑抑制膀胱癌細胞增殖及誘導凋亡機制的研究

王 豐，于 倩，王 華

(吉林大學中日聯誼醫院 藥劑科，吉林 長春130033)

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洛鉑抑制膀胱癌細胞增殖及誘導凋亡機制的研究

王 豐，于 倩*，王 華*

(吉林大學中日聯誼醫院 藥劑科，吉林 長春130033)

目的 研究洛鉑對人膀胱癌細胞的抑制作用，并揭示其可能的作用機制。方法 體外常規培養人膀胱癌細胞株5637。利用MTT細胞增殖法檢測洛鉑的細胞毒性；采用Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒在流式細胞儀上檢測癌細胞的凋亡程度；通過傷口愈合實驗觀察細胞的遷移；通過Transwell小室測定評估洛鉑對5637細胞侵襲和遷移能力的影響；利用蛋白免疫印跡法檢測細胞凋亡基因的表達。結果 洛鉑抑制人膀胱癌細胞并誘導其凋亡,下調膀胱癌5637細胞Survivin和Bcl-2的表達水平,上調其Bax和Caspase-3的表達水平。結論 洛鉑的細胞毒性誘導人膀胱癌細胞凋亡，有利于洛鉑對膀胱癌治療的深入研究。

洛鉑；膀胱癌；細胞凋亡；侵襲和遷移

(ChinJLabDiagn,2016,20:1634)

洛鉑是第三代鉑類抗腫瘤制劑的代表，在臨床前腫瘤模型的研究中有廣泛的活性，對于某些抗順鉑和卡鉑的腫瘤模型有較好的抑制作用[1]。研究表明，洛鉑對不同類型的腫瘤中都具有抗腫瘤活性，其中包括黑色素瘤、肝細胞癌、大腸癌、膽管癌、卵巢癌和宮頸癌等[2-7]。本實驗通過研究洛鉑對人源膀胱癌(5637)細胞株的影響及其作用機制，為洛鉑治療膀胱癌的臨床研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

洛鉑購自海南長安國際制藥有限公司；第一抗體Caspase-3、Survivin、Bax、Bcl-2、β-actin購自CST公司； 熒光第二抗體購自Odyssey公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒、0.5%結晶紫染色液購自上海翊圣生物科技有限公司；Transwell小室、Matrigel基質、RPMI-1640培養基購自Corning公司；無水甲醇、二甲基亞砜(DMSO)購自北京化工廠；吐溫20購自天津光復精細化工有限公司；青霉素和鏈霉素(×100)、胰蛋白酶-EDTA購自Biosharp公司；胎牛血清(FBS)購自Hyclone公司；噻唑藍(MTT)購自Amresco公司；蛋白測定試劑盒購自北京碧云天有限公司。

1.2 細胞的培養

人源膀胱癌(5736)細胞株購于上海中科院細胞所。細胞培養在含10%胎牛血清、1%雙抗(青霉素-鏈霉素)的RPMI-1640培養基中，于37℃、5% CO2恒溫培養箱中培養。

1.3 細胞增殖測定

通過顯微鏡計數，將細胞稀釋成濃度為1×105個/ml的細胞懸液，接種于96孔板中，每孔100 μl。在37℃、5% CO2培養箱中培養24小時。 棄去孔內上清液，加入含不同濃度洛鉑的10%血清培養基，每組設5個平行樣本，對照組加入DMSO。分別培養24 h、48 h、72 h后，每孔加入20 μl MTT (5 mg/mL),在37℃、5% CO2恒溫培養箱中孵育4 h。棄去上清液，每孔加入150 μl DMSO，將96孔板放于孔板振蕩器上振蕩20 min。酶標儀490 nm波長下檢測吸光度值(A)。計算抑制率(%)=(1-OD實驗組/OD對照組)×100%。

1.4 細胞凋亡測定

用Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒來分析不同濃度的洛鉑對人源膀胱癌(5637)細胞的凋亡作用。簡要步驟如下：將細胞(1×105個/孔)接種于6孔板中，加入含不同濃度洛鉑的10%血清培養基，培養24 h。收集細胞，用預冷的PBS洗滌2次，加入Annexin V和碘化丙啶，暗室反應10 min。數據由流式細胞儀分析。

1.5 細胞愈合遷移

通過傷口愈合遷移的測定來評估細胞的遷移能力。當細胞培養到80%-90%時，細胞單層用無菌的200 μl槍頭刮下，并加入含有不同濃度洛鉑的非血清培養基，孵育24小時后，固定并拍照。

1.6 Transwell小室遷移和侵襲

根據相關文獻的報道[8]，用Transwell小室(8微米孔徑，Corning公司)測定細胞遷移，其中實驗設計有所改進。人源膀胱癌(5637)細胞饑餓處理過夜，Transwell上室加入200 μl含有1×106個人源膀胱癌(5637)細胞的無血清培養基。在小室底部加入600 μl含10% FBS的培養基。上下小室都加入不同濃度的洛鉑。24小時后，用棉簽將上室未遷移的細胞擦去。遷移的細胞固定在甲醇中，用1%的結晶紫染色。在光學顯微鏡下隨機選擇5個視野進行計數并拍照。侵襲實驗按照文獻方法進行[9]。將Matrigel基質1∶30稀釋，加到Transwell上室膜上，37℃、5% CO2培養箱中放置2小時?；|膠聚合后，Transwell上室加入200 μl含有1×106個人源膀胱癌(5637)細胞的無血清培養基。在小室底部加入600 μl含10% FBS的培養基。上下小室都加入不同濃度的洛鉑。培養24小時后，用棉簽將上室Matrigel基質和未遷移的細胞擦去，用1%的結晶紫染色，然后在光學顯微鏡下計數。

1.7 Western blot

Western blot的實驗操作在之前文獻基礎上有所改進[10]。用含有不同濃度洛鉑的10%血清培養基處理人源膀胱癌(5637)細胞24小時，用預冷的PBS洗滌兩次，加入200 μl RIPA 裂解液，最后離心收集上清液的蛋白。用BCA法測定蛋白濃度。加入等量樣品的蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，半干轉到聚偏二氟乙烯(0.2 μ PVDF)膜上，然后將膜用5%的脫脂牛奶在室溫孵育2小時，并在4℃下與特定的第一抗體孵育過夜，PBS洗滌3次后，與相應的熒光第二抗體避光孵育，反應性條帶用Odyssey雙色紅外激光成像儀檢測結果。

1.8 數據分析

數據以平均數±標準差(SD)表示,統計比較采用雙尾t檢驗 ,P的顯著性用以下標示：*P<0.05;**P<0.01。

2 結果

2.1 洛鉑誘導人源膀胱癌5637細胞增殖

通過MTT實驗來測定洛鉑對人源膀胱癌(5637)細胞的抑制增殖效果。將人源膀胱癌(5637)細胞用濃度為5,10,20,40 μg/ml的洛鉑分別處理24,48和72小時。結果如圖1所示，洛鉑對人源膀胱癌(5637)細胞的增殖具有抑制作用，并呈濃度和時間依賴性。

圖1 洛鉑對細胞增殖的作用

2.2 洛鉑誘導人源膀胱癌5637細胞凋亡

通過Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒來評估洛鉑對人源膀胱癌(5637)細胞的增殖抑制作用是否與細胞凋亡有關。如圖2A和2B所示，洛鉑處理人源膀胱癌(5637)細胞24小時后，可明顯觀察到人源膀胱癌(5637)細胞凋亡的顯著增加。當洛鉑濃度為0 μg/mL時，凋亡率分別為1.5%、11.8%、27.6%、34.4%、45.8%(**P<0.01)。

用Western blot檢測5637細胞的凋亡相關蛋白。在洛鉑給藥24小時后，提取蛋白，檢測Caspase-3、Survivin、Bax和Bcl-2蛋白表達。如圖2C所示，Caspase-3和Bax蛋白以濃度依賴性的方式增加，而Survivin和Bcl-2蛋白以濃度依賴性的方式降低。

圖2 洛鉑對細胞凋亡的作用

2.3 洛鉑抑制人源膀胱癌5637細胞遷移和侵襲

通過傷口愈合實驗和Transwell小室遷移測定實驗評估洛鉑能否抑制5637細胞遷移和侵襲的能力，如圖3A所示，孵育24小時后細胞遷移到傷口區域，從10 μg/ml的洛鉑濃度開始，抑制遷移的效果比較明顯。如圖3B所示，Transwell小室遷移的結果與傷口愈合實驗相吻合。通過Transwell小室侵襲實驗來評估人源膀胱癌(5637)細胞在不同洛鉑濃度時侵入膜屏障的能力。如圖3C所示，洛鉑處理組侵入的細胞明顯減少。

圖3 洛鉑對細胞遷移和侵襲的影響

3 討論

有研究表明，化學療法促進細胞凋亡是殺傷癌細胞的關鍵機制，腫瘤細胞的敏感性可能影響到化學療法的效果[11]。因此，在本研究中，我們通過誘導細胞凋亡的方式來證實洛鉑抑制癌細胞增殖和降低癌細胞的生存率。MTT法的測定表明，洛鉑以劑量依賴性和時間依賴性的方式抑制5637細胞增殖和生長。通過組間兩兩的對比，可以發現72小時后給藥10 μg/ml,20 μg/ml,40 μg/ml的細胞抑制率逐漸趨于平緩，也就是說，當藥物抑制率達到一定程度時，增加藥物濃度并不能再提高藥物的抑制率，反而會導致其他的副作用并降低患者的化療耐受性。Caspase-3和Bax以濃度依賴性的方式增加，而Survivin和Bcl-2以濃度依賴性的方式降低。Bcl-2家族的促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2參與凋亡的內在誘導[12,13]。Caspase-3可通過線粒體依賴性凋亡途徑誘導凋亡[14]。抑制細胞凋亡(IAP)蛋白家族的最小成員Survivin參與抑制細胞凋亡的內在和外在途徑[15]。因此，線粒體介導的凋亡途徑可能部分的證實了洛鉑誘導膀胱癌細胞的最后凋亡。

遷移和侵襲是惡性腫瘤的主要特征之一，也是導致患者死亡的根本原因。因此，抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲可以有效的防止腫瘤的轉移[16]。在本研究中，我們通過體外靶向腫瘤細胞的遷移和侵襲來證明洛鉑對膀胱癌的抗轉移能力。實驗結果表明，用洛鉑處理的5637細胞可以有效的抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲。

綜上所述，洛鉑能明顯的抑制膀胱癌細胞的體外生長，通過與線粒體相關Caspase-3，Bax蛋白上調和Survivin，Bcl-2蛋白下調的途徑誘導細胞凋亡，抑制細胞遷移和侵襲，為以后的臨床研究提供參考依據。

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Inhibitory Effect of Lobaplatin on Cell Proliferation of Bladder Cancer and Possible Mechanism of Inducing Apoptosis

WANGFeng,YUQian,WANGHua.

(DepartmentofPharmacy,China-JapanUnionHospitalofJilinUniversity,Changchun130033,China)

Objective To assess the inhibition effect of lobaplatin on human bladder cancer cells,and reveal the possible mechanisms.Methods Bladder cancer cell line 5637 was routinely cultured in vitro.The cytotoxic effect of lobaplatin was determined by MTT cell proliferation assay;Annexin V-FITC / PI KIT was used to detect the degree of apoptosis by flow cytometry;Wound healing assay was conducted to inspect the migration of cells;Transwell chamber assay was completed to assess the effect of lobaplatin on invasion and migration of the bladder cancer cells;western blot was performed to detect the expression of apoptotic gene.Results Lobaplatin can inhibit human bladder cancer cells and induce apoptosis.In addition,lobaplatin can decrease the expression of Survivin and Bcl-2and increase the expression of Bax and Caspase-3 in the cell line 5637.Conclusion Lobaplatin cytotoxicity can induce apoptosis of bladder cancer cells,which is helpful to in-depth study on the therapy of bladder cancer using lobaplatin.

Lobaplatin;Bladder cancer;Apoptosis;Invasion and migration

吉林省白求恩自然科學基金(20160101032JC)

1007-4287(2016)10-1634-04

R737.14

A

2015-08-28)

*通訊作者