熱痹康湯對膠原誘導性關節炎大鼠滑膜P38/NF—κB信號通路的影響

龐學豐　蒙宇華

【摘 要】目的：觀察清熱解毒抗風濕方藥——熱痹康湯對膠原誘導性關節炎（CIA）大鼠滑膜P38/核轉錄因子-κB（NF-κB）信號通路的影響。方法：將60只SPF級雌性Wistar大鼠隨機分為空白對照組，模型對照組，熱痹康湯低、中、高劑量組，甲氨蝶呤組，每組10只。除空白對照組外，其余各組大鼠采用弗氏不完全佐劑乳化的牛Ⅱ型膠原蛋白誘導CIA大鼠模型。造模成功后開始給藥，模型對照組予生理鹽水灌胃，熱痹康湯低、中、高劑量組分別給予熱痹康湯提取物低、中、高劑量灌胃，甲氨蝶呤組給予甲氨蝶呤腹腔注射，空白對照組大鼠自由飲水和進食。觀察不同劑量熱痹康湯對CIA大鼠滑膜P38/NF-κB信號通路的影響。結果：熱痹康湯能下調CIA大鼠滑膜P38/NF-κB信號通路相關分子P38 MAPK、NF-κB/P65、IκBα的表達。結論：熱痹康湯治療類風濕關節炎的作用與抑制滑膜P38/NF-κB信號通路有關。

【關鍵詞】 膠原誘導性關節炎；關節炎，類風濕；熱痹康湯；P38 MAPK；NF-κB；大鼠

【ABSTRACT】Objective：To observe the effect of Rebikang Tang（熱痹康湯）on the P38/NF-κB signal pathway in synovial membrane of rats with arthritis induced by collagen（CIA）.Methods：Sixty female Wistar rats of grade SPF were randomly divided into a blank control group，a model control group，low，middle and high dose Rebikang groups，and a methotrexate group，10 rats in each group.Except the blank control group，the rats in the other groups were induced by typeⅡ collagen to establish CIA rat models.Rat models in the model control group were given intragastric administration of physiological saline.Models in the low，middle and high dose Rebikang groups were given intragastric administration of low，middle and high dose of Rebikang Tang.Rat models in the methotrexate group were given intraperitoneal injection of methotrexate.Rats in the blank control group were only fed with water and food.Effect of Rebikang Tang on the P38/NF-κB signal pathway in each group was observed.Results：Rebikang Tang could down-regulate the expression of related molecules P38 MAPK，NF-κB/P65 and IκBα of the P38/NF-κB signal pathway in synovial membrane of CIA rats.Conclusion：The role of Rebikang Tang in the treatment of rheumatoid arthritis is related to the inhibition of the P38/NF-κB signal pathway in synovial membrane.

【Keywords】 collagen-induced arthritis；arthritis，rheumatoid；Rebikang Tang（熱痹康湯）；P38 MAPK；NF-κB；rats

類風濕關節炎（rheumatoed arthritis，RA）的病因迄今尚未完全明確，未經系統規范治療將會出現關節破壞和功能喪失。核轉錄因子-κB（NF-κB）作為信號轉導的樞紐，在RA等免疫相關性疾病的發病過程中發揮重要作用，而P38絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）在該細胞信號傳導通路中起著重要的中介作用，可能成為RA治療的新靶點。本實驗擬通過熱痹康湯對CIA大鼠滑膜細胞P38/NF-κB信號通路影響的研究，進一步明確其治療RA的作用原理。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 實驗用SPF級雌性Wistar大鼠

60只，體質量（110±10）g，購自廣西中醫藥大學實驗動物中心，動物合格證號：桂醫動字第11005號。不限制飲水和進食，適應性鼠顆粒飼料飼養1周后，按計劃進行各項實驗。

1.2 試 劑 牛Ⅱ型膠原蛋白（南京奧多福尼生物科技有限公司）；不完全弗氏佐劑（美國Sigma公司）；P38 MAPK、NF-κB/P65、IκBα檢測試劑盒（瑞士Roche公司）；水合氯醛（美國Life technologies公司）；冰醋酸[生工生物工程（上海）有限公司]。

1.3 實驗藥物 注射用甲氨蝶呤（MTX，5 mg，廣州嶺南制藥有限公司，國藥準字H20054692）。熱痹康湯提取物（RBK）是使用乙醇對熱痹康湯（秦艽10 g、防風10 g、桂枝4 g、威靈仙15 g、制川烏6 g、地龍10 g、桑枝10 g、葛根15 g、忍冬藤20 g、青風藤10 g、黃柏10 g、蒼術10 g）進行萃取、溶解并提取上清液制成，實驗前按比例加入乙醇和生理鹽水進行溶解配制備用，具體由本院新藥研發中心制備。

2 方 法

2.1 實驗造模及分組 將所有大鼠放置于鼠籠中進行適應性飼養，觀察7 d后隨機分為空白對照組，模型對照組，熱痹康湯低、中、高劑量組，MTX組，每組10只。除空白對照組外，其余各組大鼠參照文獻[1]方法依次進行實驗造模：在無菌實驗條件下，用冰醋酸充分溶解牛Ⅱ型膠原蛋白（操作于冰面上進行），隨后把它和等體積的弗氏不完全佐劑一起注入醫用三通管內，用注射器互相推吸充分混合乳化成油包水狀，即成CⅡ乳劑，放置4 ℃冰箱保存過夜備用。進行造模時，分別于大鼠背、尾部皮內多點注射CⅡ乳劑，14 d后再次注射CⅡ乳劑進行免疫（方法和劑量同前）。評分在4分以上，大鼠四肢足爪均嚴重腫脹、踝關節直徑增長幅度≥2 mm則為造模成功。本次實驗中大鼠造模全部成功，并且沒有死亡大鼠。

2.2 藥物干預 造模成功后開始給藥，模型對照組予生理鹽水2 mL·（100 g）-1灌胃，每日

1次；MTX組以MTX 5 mg溶于10 mL生理鹽水為

0.5 mg·mL-1，按70 kg人體質量與200 g大鼠換算系數為0.018，按MTX每周1.9 mg·kg-1腹腔注射給藥；熱痹康湯高劑量組予RBK31.25 g·（100 g）-1·d-1

灌胃，中劑量組予15 g·（100 g）-1·d-1灌胃，低劑

量組予7.5 g·（100 g）-1·d-1灌胃，每日分2次進行；空白對照組大鼠自由飲水和進食。

2.3 取材及組織處理 28 d后，所有大鼠以水合氯醛進行腹腔注射，迅速麻醉后頸椎脫臼法處死，逐層分離膝關節各層組織，打開關節腔，可見由髕骨下極向下延續有一層淺淡黃色平滑光亮的滑膜組織，用手術刀片小心切下，再用眼科直鑷進行鈍性分離并完整剝離滑膜組織，冰凍保存備測。

2.4 P38和NF-κB檢測 實驗中采用Western blot 法依次檢測各組大鼠關節滑膜細胞P38MAPK、NF-κB/P65、IκBα的表達，所有操作嚴格按照說明書進行，步驟如下：于低溫下將各組大鼠關節滑膜組織進行勻漿，隨后加入適量蛋白裂解液，放置于冰上40 min，置入12 000 r·min-1離心機進行離心后取上清。以BSA 為標準對照，應用Bradford 法對上清進行蛋白定量。選取20 μg蛋白樣品，10% SDS-PAGE電泳，100 V轉移1 h至硝酸纖維素薄膜上，一起放入封閉液中37 ℃封閉1 h；一抗4 ℃過夜。實驗中采用不含抗體TBS-T液孵育作為陰性對照。多次反復洗膜后，將膜與堿性磷酸酶標記的抗IgG抗體進行孵育，輕輕搖蕩1 h（室溫下進行），再次洗膜后，用Western blot印跡進行觀察研究，最后采用圖像分析測定各帶吸光度（A）值作定量分析，作出結果判斷。

2.5 統計學方法 采用SPSS 17.0軟件進行統計分析。計量資料以表示，采用方差分析或t檢驗對各組間資料進行比較。以P < 0.05為差異有統計學意義。

3 結 果

與空白對照組比較，模型對照組大鼠的滑膜細胞P38 MAPK、NF-κB/P65、IκBα的表達量均有不同程度的升高（P < 0.05）。與模型對照組比較，熱痹康湯各治療組與MTX組大鼠滑膜細胞P38 MAPK、

NF-κB/P65的表達量均有降低（P < 0.05或P < 0.01）。低劑量RBK對大鼠滑膜細胞IκBα無明顯抑制作用，高、中劑量RBK與MTX對大鼠滑膜細胞IκBα的表達均有抑制作用。見圖1、表1。

4 討 論

RA的發病過程中存在著眾多細胞因子的參與，P38/NF-κB信號通路在細胞因子的激活過程中起著“開關”作用，研究表明，P38 MAPK是炎性細胞應答過程中最重要的家族成員之一，

P38 MAPK信號傳導通路可被多種刺激因子激活，可參與細胞的多種生理過程[2]。研究資料證實，P38 MAPK可調控與RA骨侵蝕有關的破骨細胞的

分化[3]。

NF-κB與抑制物IκB結合以后存在于細胞質當中，但其本身沒有活性，主要通過降解IκB而激活[4]。NF-κB活化后啟動炎癥遞質基因的轉錄，誘導IκB的表達增強，新生的IκB進入細胞核后與NF-κB反應，使NF-κB從DNA上解離并轉移到胞漿中，變成無活性狀態，IκB還與游離的NF-κB結合，抑制其活化[5]。研究表明，體內NF-κB信號通路的活化過程調控是通過經細胞外的正反饋途徑以及經細胞內、外的負反饋途徑實現的[6]。

NF-κB的調控與活化在RA的病理變化占有重要地位。在RA發病的過程中，腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素（IL）-1、IL-2、IL-8等致炎細胞因子均是通過NF-κB信號通路，激活相關因子，參與免疫應答過程，誘發炎癥反應，導致關節的損傷。本次實驗研究發現，在致炎后的膠原誘導性關節炎大鼠中NF-κB的活性明顯升高，結果提示，NF-κB參與了膠原誘導性關節炎的炎癥調控過程。有研究表明，NF-κB表達增加與MAPK信號傳導系統有關，如TNF-α和IL-1等通過與細胞膜上的受體結合，進而激活中性鞘磷脂酶，再進一步活化神經酰胺活化蛋白而激活MAPK通路，誘導NF-κB的表達而產生炎性因子[7]。因此，抑制P38/NF-κB信號通路的活化成為RA新的治療

靶點。

RA屬中醫學“痹病”“歷節病”等范疇，多因稟賦不足，人體正氣虧虛，衛外不固，或病后、產后腠理疏松，感受濕熱之邪，痹阻肌肉、經絡，氣血凝滯而致。本虛標實是本病的病理性質，本虛為氣血、陰陽、臟腑虧損，標實為外受濕熱之邪。熱痹康湯是筆者根據多年臨床體會總結的經驗方，具有清熱解毒、利濕除痹止痛功效，前期臨床應用表明具有較好的療效，無明顯毒副作用[8]。前期課題研究發現，熱痹康湯能降低CIA大鼠血清IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α及基質金屬蛋白酶-3水平，升高IL-4、IL-10的水平[9-12]。

本研究結果提示，熱痹康湯對P38 MAPK、NF-κB/P65以及IκBα的表達均有抑制作用，其抑制作用呈劑量依賴型，能下調CIA大鼠滑膜P38/NF-κB信號通路的表達，這一研究結果為熱痹康湯對RA的靶向治療及臨床研究提供一定的實驗依據。

5 參考文獻

[1] 鄧安梅，仲人前，陳孫孝，等.關節炎中B7：CD28/CTLA-4共刺激途徑的實驗研究[J].中國免疫學雜志，2000，16（8）：412-414.

[2] Chabaud-Riou M，Firestein GS.Expression and activation of mitogen-activated protein kinase kinases-3 and -6

in rheumatoid arthritis[J].Am J Pathol，2004，164（1）：177-184.

[3] Pargellis C，Regan J.Inhibitors of p38 mitogen-activated protein kinase for the treatment of rheumatoid arthritis[J].

Arrop in Ivest Drugs，2003，4（5）：566-571.

[4] May MJ，Ghosh S.Signal transductin through NF-κB[J].Immunol Today，1998，19：80-88.

[5] Lee EG，Boone DL，Chai S，et al.Failure to regulate TNF-α induced NF-κB and death responses in A20 deficient mice[J].Science，2000，289（5488）：2350-2534.

[6] Koul D，Yao Y，Abbruzzese JL，et al.Tumor suppressor MMAC/PTEN inhibits cytokine-induced NFkappa B activation without interfering with the IkappaB degradation pathway[J].J Biol Chem，2001，276（14）：11402-11408.

[7] Han Z，Boyle DL，Manning AM，et al.AP-1 and NF-kappaB rgulation in rheumatoid arthritis and murine collagen induced arthritis[J].Autoimmunity，1998，28（4）：197-208.

[8] 龐學豐，蒙宇華.熱痹康膠囊治療濕熱型類風濕性關節炎86例[J].廣州中醫藥大學學報，2003，20（2）：106-108.

[9] 劉歡，龐學豐.熱痹康湯對實驗性關節炎大鼠血清IL-2及IL-10的影響[J].廣西中醫藥，2010，33（1）：48-50.

[10] 劉歡，龐學豐，吳燕紅，等.熱痹康湯對膠原誘導性關節炎大鼠血清IL-1β及IL-4的影響[J].江西中醫學院學報，2012，24（1）：55-57.

[11] 龐學豐，龍朝陽，劉歡，等.熱痹康湯對膠原誘導性關節炎大鼠血清TNF-α及IL-6的影響[J].廣西中醫藥，2012，35（2）：51-52.

[12] 龐學豐，李玉玲，劉歡，等.熱痹康湯對膠原誘導性關節炎大鼠血清基質金屬蛋白酶-3的影響[J].風濕病與關節炎，2013，2（4）：32-34.

收稿日期：2016-08-24；修回日期：2016-09-22