人類microRNA—1246慢病毒抑制載體的構建以及鑒定

賴月華　姚德生　杜萍　盧艷

摘要：目的 構建microRNA-1246慢病毒抑制載。方法 針對microRNA-1246成熟體的反義核苷酸片段， 應用基因重組技術將目的基因片段克隆到GV280慢病毒載體中，通過酶切、PCR、DNA測序驗證重組克隆的成功構建，將GV280-mir-1246down、Helper1.0、Helper2.0共轉染293T細胞獲得重組慢病毒， 濃縮提純病毒液并檢測病毒滴度，用病毒液感染siha細胞，通過檢測綠色熒光蛋白（GFP）驗證GV280-mir-1246down在siha細胞的表達情況，用嘌呤霉素篩選GV280-mir-1246down穩轉細胞株。用細胞計數的方法檢測細胞的生長率。結果 ①對菌落進行PCR鑒定篩選出構建正確的慢病毒載體，DNA測序證實插入的基因序列正確；②GV280-mir-1246down、Helper1.0、Helper2.0共轉染293T細胞產生重組慢病毒；③目的mir-246down被慢病毒成功導入siha細胞中，同時達到穩定表達，轉到率幾乎達100%，熒光顯微鏡下能直接觀察到GFP；④細胞計數結果顯示在siha細胞中microRNA-1246的下調細胞的生長速度減弱。結論 成功構建microRNA-1246慢病毒抑制載體，建立siha細胞mir-1246-down的穩轉株，microRNA-1246在siha細胞中下調的siha細胞的增殖能力下降.這為研究microRNA-1246在宮頸鱗癌siha細胞的作用及其機制提供了可靠的基礎。

關鍵詞：慢病毒載體；microRNA；抑制載體；宮頸癌；細胞增殖

Construction and Identifacation of a Lentiviral Vector for MicroRNA-1246 of Human Inhibition

LAI Yue-hua，YAO De-sheng，DU Ping，LU Yan

（ Department of Gynecologic Oncology，The Affiliated Tumor Hospital，Guangxi Medical University，Nanning 530021，Guangxi，China）

Abstract：Objective To construct and identify a lentiviral vector for microRNA-1246 inhibiton.Methods The gene sequences of microRNA-1246 Antisenseolignuclleotides were chosen， the antisense sequences of microRNA-1246 were designed and linked into linearized GV280 vector. The recombinants were screened and identified by colony PCR and DNA sequencing， The GV280-mir-246down，Helper1.0、Helper2.0 were mixed in suitable proportion and then transfected into the cell of 293T to get recombinant lentiviral vector.The concentrated and purified of virus bulk were detected the drops of it，indeed the virus was used to infect the carcinoma cell of Cervical squamous of siha .The GV280-mir-1246down，s expression in the siha cell tested by testing the GFP.Results ①The corrected of recombination lentiviral vector was screened from the bacterial which was anthenticated by PCR，DNA testing proved that the inserted gene sequence was correct . ②The cells of 293T which was transfected GV280-mir-1246down、Helper1、0 and Helper2.0 produced recombinant lentiviral vector.③The target gene sequences were successfully inserted into siha cell by GV280 lentiviral vector ，the recombinant lentiviruses which carring mir-246down could infect and deliver mir-246down and GFP genes to siha cells. The infection efficiency was almost 100%. Conclusion The lentiviral microRNA inhibitor vector has been successfully constructed，which provides a stable tool for further study of therole of microRNA-1246 on cervical cancer.

Key words： Lentiviral vector；MicroRNA； Inhibiton vector；Cervical cancer；Cell proliferation

MiRNA是一類由20-23個堿基組成的非編碼單鏈RNA，MiRNA與靶基因mRNA的非翻譯區域的堿基互補配對，MiRNA與靶基因mRNA結合形成沉默復合體使mRNA降解，從而阻礙mRNA的翻譯[1]。腫瘤細胞的多種生物學行為受到MiRNA的調控，MiRNA的功能與細胞的分化、增殖、凋亡、耐藥、侵襲及轉移等密切相關[2]。我們的前期實驗表明microRNA-1246的表達量在宮頸癌患者的癌組織中較正常人宮頸組織升高，microRNA-1246的表達量在宮頸癌患者的癌組織中較癌旁組織升高，microRNA-1246是一個促癌因子，miR-1246對人宮頸癌SiHa細胞增殖、侵襲、遷移能力具有一定的影響[3]。慢病毒（Lentivirus）載體是將人類免疫缺陷I型病毒（HIV-1）改良后發展起來的用于基因治療的載體，是逆轉錄病毒的一種。它對非分裂細胞和分裂細胞均具有較強的感染能力，該載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達到持久性表達，因為對該病毒進行了改良，使之失去了傳染性能，因此安全性高。作為干預宮頸鱗狀細胞癌生長及體內試驗的措施之一，我們構建了miR-1246慢病毒過表達載體及抑制載體，為進一步觀察miR-1246在宮頸鱗狀細胞增殖中的作用及其機制奠定了基礎。

1 資料與方法

1 一般資料

1.1.1細胞來源以及培養 人胚胎腎細胞（293T）、人宮頸鱗狀細胞癌細胞（siha）均購于上海中國科學院。293T細胞用含10%的FBS的DMEM培養，siha用含10%的FBS的1640培養。

1.1.2質粒及菌株 攜帶增強綠色熒光蛋白（EGFP）的慢病毒載體GV280以及Helper1.0 、Helper2.0購自上海吉凱基因科技有限公司。GV280具有綠色增強熒光蛋白（EGFP）標志和ampricillin抗藥基因。感受態大腸桿菌DH5α菌株購于北京天根生物科技公司。

1.1.3主要試劑 限制性內切酶AgeⅠ、EcoRⅠ限制性內切酶 T4DNA連接酶購自NEB公司，DL10，000 DNA Marker購于上海TaKaRa公司，2×Taq PCR Master Mix購于上海吉凱基因科技有限公司，質粒DNA提取試劑盒和DNA膠回收試劑盒購自北京天根生物科技公司，PCR引物合成及質粒測序由上海吉凱基因科技有限公司進行。

1.2方法

1.2.1引物設計及合成 根據mirBase數據庫得到hsa-miR-1246 MIMAT0005898 AAUGGAUUUUUGGAGCAGG據DNA重組要求及其他文獻[4]報道，設計抑制載體上游引物5 AATTCAAAAAA-ATGGATTTTTGGAGCAGG-3，下游抑制載體引物5- CCGG - CCTGCTCCAAAAATCCATT -3。在上游引物的5端及3端分別加入限制性內切酶AgeⅠ及EcoRⅠ酶切位點及相應的保護堿基，在上游引物的3端加入6個T作為終止子。

1.2.2重組慢病毒質粒的構建 microRNA-1246抑制GV280載體，GV280轉化感受態大腸菌DH5α進行質粒擴增，質粒大提后獲得足夠量的GV280載體。GV280質粒用限制性內切酶AgeⅠ及EcoRⅠ酶切，按照酶切說明書操作，置于37°反應3 h或過夜，對載體酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳，回收目的條帶，并測定其濃度。對引物進行PCR擴增得到相應的DNA產物，并對PCR產物進行電泳鑒定。PCR產物與雙酶切線性化載體以2：1的比例在T4DNAligase作用下進行連接，按照說明書操作，16°連接3 h或過夜。連接產物直接轉化感受態細胞，涂布于含氨芐霉素的LB固體培養基的平板上孵育，37°5%的CO2培養過夜。

1.2.3重組慢病毒質粒的鑒定 挑取固體LB培養板上長出的單顆菌落接種于含有氨芐霉素的5ml LB液體培養基進行培養，分好組，并置于37°、200 r/min的恒溫搖床振蕩，10～16 h后行對液體培養基中的大腸桿菌行PCR鑒定，引物為載體測序引物，對 GV280-mir1246-down插入基因microRNA-1246進行自動測序，與microRNAbase中反義核苷酸序列比較。將陽性克隆的培養菌液取100 μl送測序檢查，測序采用下游測序引物進行反向測序。測序結果與原始序列進行比對。將正確插入載體質粒的轉化菌放入500 ml含氨芐霉素的LB培養液中，37°振蕩過夜，用無內毒素質粒大提試劑盒按照廠家提供的說明書提取質粒DNA，測定濃度（1 ug/ul）和純度，用作以后的轉染。

1.2.4 GV280-mir-1246down質粒表達GFP的檢測 用lipo200分別將重組質粒轉染293T細胞，于轉染24 h后在熒光顯微鏡下可觀察綠色熒光蛋白GFP的表達。

1.2.5 GV280-mir-1246down重組慢病毒的包裝與質量檢測 包裝質粒Helper1.0、Helper2.0分別感受態大腸桿菌DH5α進行擴增，接種于含有氨芐青霉素的LB固體培養基上，挑取單顆克隆菌落于5 ml的LB培養基擴增，用無內毒素質粒大提試劑盒提取質粒并檢測質粒濃度。用lipo2000將GV280-mir-1246down+ Helper1.0、Helper2.0共轉染包裝細胞293T.48～72 h，收集培養液上清，1500 r/min離心5 min去除細胞碎片。再用孔徑為0.45 um的一次性細胞濾器過濾去除所有的細胞及碎片，獲得的培養基液上清則分別為含有microRNA-1246、GFP基因的重組病毒。同時將GV280、Helper1.0、Helper2.0共轉染293T細胞（空載載體對照，重組病毒僅攜帶GFP基因）。

1.2.6慢病毒低度檢測 采用逐孔稀釋法，測定前1 d，將293T細胞接種于96孔板，每孔加入4×104個細胞，體積100 μl。分為8個組，第一組加入的病毒原液為1E+1μl；以此類推到第八個組分別為1E+0μl、1E-lμl、1E-2μl、1E-3μl、1E-4μl、1E-5μl、1E-6μl。感染病毒液24 h后在顯微鏡下觀察細胞熒光數，則該病毒的滴度就等于發熒光的細胞數除以病毒的原液量。

1.2.7慢病毒感染siha細胞 感染前先做預實驗檢測siha細胞的moi值，感染前1 d將siha細胞以5×104/ml的密度接種于24孔板（細胞融合率為30%～40%），分為3個組，分別為空白組、陰性對照組、mir-1246down，感染前1 h換成Enhance Infection Solution，然后按預實驗所得moi值加入病毒量及polybrene，8 h后換成有血清培養基，分別于24 h、48 h、72 h在熒光顯微鏡下觀察細胞熒光表達量。

1.2.8 siha細胞穩轉株的篩選；慢病毒感染siha細胞72 h后當細胞長滿到90%以上，將細胞用胰酶消化，離心，（預實驗檢測得嘌呤霉素篩選的最適濃度為2 ug/ml）用含有2 ug/ml嘌呤霉素的培養基制成懸濁液種到6孔板中，每天用2 ug/ml嘌呤霉素的培養基換液。

1.2.9細胞增殖實驗 將長到80%生長對數期的細胞消化收集種于96孔板，每孔細胞約3000個/100ul，每組設2平行組，各3個復孔，種2個板。接種后48 h起開始消化收集細胞進行計數，每隔24 h一次，連續6 d。消化下來的細胞加入臺盼藍，盼藍拒染法進行細胞計數，繪制生長曲線。

1.3統計學分析處理 數據采用 SPSS 16.0 軟件分析，多組均數間的比較采用方差分析 F 檢驗，組間兩兩比較采用 q 檢驗，P<0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1酶切鑒定結果， AgeⅠ/EcoRⅠ分別酶切GV369及GV280

，1%瓊脂凝膠電泳，紫外線下可見2個DNA片段，與理論計算片段一致。見圖1。

2.2菌落PCR結果 對LB培養板上的菌落進行PCR篩選鑒定，可見多數菌落均為陽性克?。▓D1），抑制載體酶切產物分別為陽性轉化子PCR產物大?。?71bp。

2.3載體測序結果 載體經測序證實結果符合預期，插入目的基因片段與線性載體連接正確，符合設計要求，未見堿基缺失或突變等異常，證實已成功構建此兩類載體，借助Vector NT軟件，將序列導入。繪制質粒GV280-mir1246-down結構圖。

2.4基因轉導效率的檢測結果 用重組慢病毒介導GV280-mir-1246down轉導入宮頸鱗癌siha細胞，重組病毒感染siha細胞48h后，將六孔板板放在顯微鏡下，可見到幾乎100%的活細胞表達GFP見圖3。

2.5 siha細胞穩轉株，用嘌呤霉素篩選后anti-miR-1246-LV，病毒轉染率幾乎為100%。

2.6細胞增殖實驗結果 我們發現通過感染anti-miR-1246病毒下調miR-1246的表達能夠明顯抑制宮頸癌細胞的增殖，P<0.01，差異有統計學意義。這說明miR-1246在促進宮頸癌細胞生長方面起到一定作用。

3討論

最近的研究表明microRNA參與生理或疾病狀態的調節，其中包括細胞死亡或凋亡，腫瘤的發生、發展、發育以及炎癥反應等[5]。為了更為深入地闡明microRNA的作用機制，microRNA的功能學研究是不可或缺的。MicroRNA過表達或抑制表達的功能學可以采用很多方法，其中主要包括運用體外合成的mi-croRNA化學模擬物和抑制物或構建相關載體進行轉染[6]。針對宮頸鱗癌siha細胞分裂增殖性能差及其真核載體轉染率低下的特點，本研究在以往實驗的基礎上構建了相關microRNA的慢病毒載體，為下一步載體的包裝及假病毒顆粒的制備做好準備。慢病毒載體是體內體外基因轉染的有力工具，該系統往往由3部分組成，即攜帶目的基因的載體質粒。提供病毒結構部件（gag/pol）質粒以及提供病毒衣殼的質粒構成[7]。其主要有以下優勢。首先，慢病毒不僅能夠轉染分裂期細胞，而且對分裂較慢的細胞甚至非分裂期的終末分化細胞具有同樣的轉染作用；其次，慢病毒所攜帶的目的基因更能夠耐受轉錄沉默；最后，慢病毒能適合各種普遍的或組織特異的轉錄啟動子，而且慢病毒自我失活的修飾在不降低病毒的滴度的情況下能使目的基因的表達在靶細胞內受內源性啟動子單獨的調控[8]。

本研究采用的GV280質粒，來源于HIV-1構件，所構建的載體中攜帶的目的基因在EMCV IRES的下游，具有EGFP熒光蛋白基因，能為目的基因的表達提供可靠的保證[9]。MicroRNA過表達載體的構建可以采用microRNA的前體序列作為目的基因插入載體，也有研究采用的是包含microRNA前體序列兩端的側翼序列在內的核苷酸并經基因組DNA擴增后作為目的基因插入[10]。一般情況下當細胞內microRNA高水平表達時采用反義寡核苷酸抑制其活性來下調其表達水平是目前比較理想的loss-of-fuction研究手段。

本實驗結果顯示，成功構建了慢病毒microRNA過表達表達質粒GV280-mir-1246down，具有極高的轉染效果，幾乎可以使100%的靶細胞獲得目的基因，因為它帶有GFP，可以通過熒光顯微鏡觀察有無綠色熒光GFP來了解靶細胞是否被轉導了目的基因，而無需繁瑣的免疫組化或者PCR方法驗證，簡化了實驗過程，目的基因可在2～3 d內轉導入100%的靶細胞，達到穩定表達。為轉基因的研究提供了快速、有效的工具，同時也為基因治療提供了有力的依據。細胞增殖實驗顯示，MiR-1246的下調可以抑制宮頸癌siha細胞的增殖能力，MiR-1246是宮頸鱗狀上皮癌的致癌基因，它的下調表達可以明顯的抑制宮頸癌細胞的增殖。

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編輯/金昊天