二硫鍵在蛋白質中的作用及其氧化改性研究進展

鐘 新，李軍生*，閻柳娟，黃國霞，王 薇

（1.廣西科技大學生物與化學工程學院，廣西柳州545006；2.廣西糖資源綠色加工重點實驗室，廣西柳州545006；3.廣西高校糖資源加工重點實驗室，廣西柳州545006）

綜述

二硫鍵在蛋白質中的作用及其氧化改性研究進展

鐘 新1，2，3，李軍生1，2，3*，閻柳娟1，2，3，黃國霞1，2，3，王 薇1，2，3

（1.廣西科技大學生物與化學工程學院，廣西柳州545006；2.廣西糖資源綠色加工重點實驗室，廣西柳州545006；3.廣西高校糖資源加工重點實驗室，廣西柳州545006）

蛋白質是維持一切生命活力的基礎，含有較多的二硫鍵，但是目前有關二硫鍵的相關研究相對較少。本文簡述了二硫鍵的構成要素；從二硫鍵對蛋白質結構和表面活性影響的角度分析了二硫鍵的重要性；對采用打開二硫鍵的方法提高蛋白質表面活性的可行性和近年來采用氧化改性提高蛋白質表面活性的研究進展進行了綜述。

二硫鍵；蛋白質；表面活性；氧化改性

二硫鍵存在于很多蛋白質和多肽當中，是維持蛋白質結構穩定的重要共價鍵之一，不同于氫鍵、靜電作用和范德華力，二硫鍵的穩定性幾乎完全依靠二硫鍵的周圍環境（Creighton，1988），可以通過氧化還原作用使二硫鍵和游離巰基含量發生改變。二硫鍵的形成對兩個半胱氨酸的位置和方向有著嚴格的立體化學要求，天然二硫鍵的形成要求兩個硫原子之間的距離必須在2.05到2.08之間，二硫鍵與每個色氨酸殘基的β-碳原子的夾角必須接近103°，且兩個硫原子與各自相連的β-碳原子形成的兩個S—C鍵的夾角保持90°（Creighton，1988）。二硫鍵的存在嚴重限制了蛋白質分子結構的伸展，所以它們影響著結構的柔性和緊實度，這是蛋白質分子結構穩定性和功能性質的決定性因素（Gekko等，2003）。對蛋白質結構的影響主要表現在穩定蛋白質的天然結構、促進蛋白質正確折疊以及防止疏水基團的暴露三個方面。從結構上講，任何蛋白質都是由疏水和親水兩種氨基酸組成，天然蛋白質在折疊的過程中，由于二硫鍵鎖定的緣故，疏水基團一般被包裹在分子內部，可以有效防止疏水基團與水等溶劑的接觸，這在一定程度上降低了蛋白質的表面活性。通常情況下，二硫鍵的斷裂或錯誤連接會導致蛋白質結構變得疏松以及內部結構的暴露。

1 二硫鍵對蛋白質結構的影響

雖然人們通過凝膠排阻層析法、小角X射線衍射等方法對還原態二硫鍵進行了大量的研究，但是對于二硫鍵維持蛋白質結構穩定性機理的相關數據依然很有限，一般認為構象熵的變化是蛋白質天然構象失穩的重要原因（Klink，2000）。

楊程（2010）采用分子動力學模擬從分子水平研究了二硫鍵對胰島素結構穩定性的影響，發現二硫鍵斷裂后，A、B鏈解離，B鏈的中心螺旋趨于失穩，胰島素穩定性降低。Klink（1992）通過對核糖核酸酶A（RNase A）的二硫鍵進行突變研究了二硫鍵對蛋白構象穩定性的影響，結果表明，每個二硫鍵突變去折疊有兩種狀態過程，每個二硫鍵對蛋白質的構象穩定性都有很大的影響，且兩個終端的二硫鍵比兩個嵌入式二硫鍵對維持蛋白質結構穩定作用更大。Kang（2003）采用β-巰基乙醇斷裂二硫鍵的方法研究了牛血清白蛋白（BSA）結構的變化，發現隨著二硫鍵斷開程度的增加，色氨酸基團熒光強度下降且最大發射峰位藍移，表明隨著二硫鍵斷開程度增加蛋白質逐漸變性，疏水環境的色氨酸逐漸發生變化；同時遠紫外圓二色譜表明二硫鍵斷裂后蛋白質的α-螺旋含量沒有顯著變化，表明二硫鍵斷裂對蛋白質的二級結構影響不大。Kella（1989）研究二硫鍵對乳清蛋白結構的影響，當二硫鍵斷開率在25%和50%時內源熒光分別紅移了7 nm和12 nm；二硫鍵斷開率進一步提高內源熒光開始藍移。Kalapathy（1997）分別用10 mmol/L的β-巰基乙醇和6 mmol/L的尿素斷開大豆蛋白的二硫鍵，發現二硫鍵全部斷裂后色氨酸最大發射峰位藍移，色氨酸殘基暴露向著非極性的環境轉移，說明分子的部分去折疊發生在色氨酸基團附近。二硫鍵斷裂除了會引起色氨酸基團微環境的變化，還會引起二級結構的變化。如Kella（1988）對二硫鍵斷裂導致BSA結構的變化進行了詳細的分析，紫外差示光譜顯示S—S斷裂后287～288 nm的負峰出現藍移，在279 nm處出現肩峰，表明酪氨酸殘基集中在Ⅰ區和Ⅱ區，且二硫鍵斷裂后由于結構發生變化導致酪氨酸殘基從內部向外部水環境轉移；內源熒光光譜顯示隨著二硫鍵斷開率增加，內源熒光強度逐漸下降且最大發射峰位逐漸藍移，認為是由于二硫鍵斷裂后蛋白質變性、分子柔性增加導致色氨酸基團由非極性環境向極性環境轉移；同時遠紫外圓二色譜表明，隨著二硫鍵的斷裂，α-螺旋含量降低，β-折疊和轉角含量增加；當二硫鍵全部斷裂后，α-螺旋含量由原來的54.8%減少至15.4%，而β-折疊和轉角的含量分別由原來的9.4%、3.9%升高至32.4%和13.7%。從以上數據可以得出二硫鍵斷裂后改變了蛋白質的三級結構。黎陽（2012）研究了二硫鍵斷裂后對胰島素二級結構的影響，試驗結果表明，二硫鍵斷裂后α-螺旋含量出現了不同程度的下降，β結構含量略有升高。有研究發現，溶菌酶二硫鍵被斷裂后導致無規則卷曲含量顯著增加，分子之間相互聚集（Goldberg等，1991）。Gekko（2003）研究了二硫鍵對五種球蛋白的體積、緊實度、熱膨脹性的影響，發現當二硫鍵全部斷裂后，圓二色譜和熒光光譜顯示球蛋白的二級和三級結構部分遭到破壞，構象變化伴隨著微分比容、絕熱壓縮系數下降和熱膨脹性的提高，表明球蛋白的內部空腔降低和表面水合作用提高。

2 二硫鍵對蛋白質表面活性的影響

二硫鍵是維持蛋白質結構穩定的重要共價鍵之一，由于蛋白質的結構特點，內部疏水基團無法轉移至分子表面，這在很大程度上制約了蛋白質分子的表面活性。蛋白質的去折疊可以使分子更好的排列在油水或氣液界面，形成更穩定的構象熵，在很大程度上提高蛋白質的表面活性（Kella等，1989）。一般考察蛋白質的乳化性、起泡性、黏度、表面疏水性等表面活性的變化情況。如Kella（1986）研究了二硫鍵斷裂對大豆球蛋白和亞基表面活性的影響，發現二硫鍵的斷裂改變了蛋白質的溶解性和等電點，表面疏水性都呈現出升高的趨勢，同時發現二硫鍵的斷裂有利于蛋白質的體外消化。1989年，Kella等（1989）又研究了乳清蛋白二硫鍵斷裂后蛋白質在氣液界面行為的變化，研究結果表明，pH在6.0～2.0，二硫鍵全部斷裂后乳清蛋白的不溶性蛋白占到95%～100%；二硫鍵斷開率≤50%時，表面疏水性提高，蛋白質黏度和表面壓力增加，當二硫鍵斷開率大于75%時表面疏水性減小，蛋白質黏度和表面壓力下降；隨著二硫鍵的斷裂程度的增加，乳清蛋白的起泡能力逐漸提升，且有效提高了起泡穩定性，在二硫鍵斷開率為75%時穩定性最好。二硫鍵在斷裂過程中形成的磺酸基團帶來的負電荷顯著提高了蛋白質的表面電荷，當二硫鍵斷開率為25%、50%、75%和100%時乳清蛋白的等電點分別為4.74、4.38、4.2和4.0。Kang（2003）在對BSA的研究中發現，天然BSA乳化性穩定性較差，隨著二硫鍵的斷裂程度增加，BSA的乳化穩定性得到提高。二硫鍵斷裂后蛋白質結構展開有效提高了疏水基團使蛋白質去折疊后可以很好地吸附在油水界面，大大提高了BSA的乳化活性。Snouwaert（1991）研究了二硫鍵對人白細胞介素活性的影響，發現cys45-cys51二硫鍵的缺失比半胱氨酸自由突變具有更高的生物活性。Kalapathy等（1997）對大豆蛋白的改性發現，由于二硫鍵的斷裂導致蛋白質去折疊，溶液中的疏水性蛋白質含量增加，大豆蛋白的溶解性顯著提高，當二硫鍵斷開率為28%時，大豆蛋白的黏度、粘合強度和疏水特性最佳，但是二硫鍵的斷裂對蛋白的粘合強度沒有顯著影響。German（1985）研究發現，隨著亞基內二硫鍵的斷裂，11S球蛋白的起泡性和起泡穩定性顯著提高。Klemaszewski（1991）發現隨著二硫鍵打開程度的提高乳清蛋白的乳化活性也隨之提高。Kim（1987）用5 mol/L和10 mol/L的二硫蘇糖醇處理大豆球蛋白，發現還原劑用量越多，11S球蛋白表面疏水性和黏度越高，表面膜的屈服應力和彈性越強，因此乳化穩定性也越強。

綜上所述，二硫鍵對維持蛋白質結構和構象穩定性具有十分重要的作用，由于二硫鍵的存在使蛋白質具有緊密的三級結構，導致蛋白質的表面活性較差。因此要改善蛋白質的表面活性可以從打開二硫鍵入手，改變二硫鍵在蛋白質中的存在形式歸結于通過氧化還原反應改變蛋白質分子中二硫鍵的含量。

3 蛋白質氧化改性

蛋白質在貯存、加工等過程中，很容易出現氧化情況，對于該類氧化造成蛋白質功能性質、風味、結構等的影響已有報道（Ye等，2015；Ye等，2013）。反應性氧系（ROS）包括：羥基自由基（·OH）、超氧自由基陰離子（O2-）、NO、過氧化物自由基（ROO-）、過氧化氮自由基（ONOO-）、單氧（1O2）、次氯酸（HClO）、過氧化氫（H2O2），另外還包括醛基和酮基（朱衛星等，2011）。蛋白質在這些物質的氧化作用下，結構和功能性質的確會引起很大的變化，羰基含量、巰基和二硫鍵含量、二聚酪氨酸含量、表面疏水性等數據成為評價蛋白質氧化程度的指標。

在氧化條件下，蛋白質巰基和二硫鍵可以相互轉化，主要是因為強氧化劑會將二硫鍵氧化成游離巰基或進一步被氧化成磺酸基團，引起分子游離巰基和二硫鍵的變化。2001年，Thomas（2001）對蛋白質的巰基和二硫鍵氧化作了詳細解釋，認為二硫鍵有兩種氧化形式，即可逆和非可逆兩種狀態，如下所示：

巰基的可逆氧化形式

巰基的不可逆氧化形式

通過以上結構、功能性質、氧化形式等分析，通常認為，二硫鍵是影響蛋白質表面活性的主要原因。因此，如要提高大豆、乳清等蛋白質的表面活性必須斷開分子中所含的二硫鍵使內部疏水性基團暴露至分子表面，通過改變蛋白質結構，增加表面疏水性改善其表面活性。目前，關于蛋白質氧化造成的結構和功能性質的變化已有報道。如蔡建勇（2013）和劉晶（2014）分別使用過氧化自由基和丙二醛對大豆蛋白氧化改性，發現溫和的氧化條件可以一定程度上提高蛋白質的表面活性，但是過度激烈的氧化會降低蛋白質的表面活性。Wu（2010、2009、2009、2009）分別采用了四種不同氧化劑對大豆蛋白進行改性，發現大豆蛋白經丙烯醛、丙二醛、過氧自由基和13-氫過氧化-順-9,反-11-十八碳二烯酸氧化后大豆游離巰基和二硫鍵含量下降，α-螺旋含量、表面疏水性、內源熒光強度下降，并推斷氧化后大豆蛋白由于非二硫鍵共價交聯形成可溶性聚集體。

通過對二硫鍵功能的分析，人們嘗試采用打開二硫鍵的方式對蛋白質進行改性。對于如何斷開二硫鍵進行了相關研究，使用的傳統生化試劑有β-巰基乙醇（β-ME）、二硫蘇糖醇（DTT）等。這些試劑可以有效斷開蛋白質中的二硫鍵，但是，這些試劑也帶來了一些不容忽視的問題，同時這類試劑不能在酸性條件下使用，有時候還會與肽段形成加合物。β-ME具有一定的毒性，會給科研工作者身體健康和環境造成危害，其次從理論上講，該類試劑在斷開二硫鍵后形成相應的巰基化合物，當這些還原劑被除去后很容易因為環境的變化導致結構展開的蛋白質出現復折疊的現象。Sanger（1949）將過甲酸斷開二硫鍵的方法運用到胰島素的研究中。Hirs（1956）進一步將該方法的應用擴大，認為過甲酸可以將半胱氨酸氧化成磺基苯丙酸。Toennies（1942）經過研究發現，過甲酸只氧化蛋白質中的色氨酸、甲硫氨酸和半胱氨酸，而不會對其他氨基酸造成較大破壞。張維農（2005）采用雙氧水氧化大豆分離蛋白發現，雙氧水可以改變大豆分離蛋白二硫鍵的含量，但是并沒有進一步研究二硫鍵和表面活性之間的關系。隨著研究的深入，李軍生（2008）提出了通過打開二硫鍵制備蛋白質基表面活性劑的方法。王微（2016）采用過甲酸改變大豆蛋白的結構，再采用海藻酸鈉進行接枝改性，結果表明，單純的海藻酸鈉改性大豆蛋白后蛋白質的表面活性并沒有很大程度提高，二硫鍵對蛋白質的表面活性和結構影響很大，認為用過甲酸氧化二硫鍵對蛋白質的分子性質具有十分重要的意義。王朗（2013）運用正交試驗研究了過氧乙酸打開大豆分離蛋白二硫鍵的最佳工藝，起泡性、乳化性等都得到了不同程度的提高。目前對于大豆蛋白化學改性的方法主要有兩種，一是通過化學修飾采用共價鍵結合將疏水基團接到分子上；二是利用非共價鍵結合或吸附使離子型表面活性劑與蛋白質分子結合。從結構上講，蛋白質自身含有較多的疏水及親水性氨基酸，受二硫鍵鎖定的影響使得天然蛋白質的表面活性較差，如果通過斷開二硫鍵的方式使內部的疏水區域轉移至極性環境中，足以提高蛋白質的表面活性。

4 展望

蛋白質是由極性和非極性氨基酸構成，其自身的氨基酸組成決定了蛋白質具有良好的表面活性。由于二硫鍵的鎖定作用，大部分的疏水性氨基酸被包裹在分子內部，絕大多數蛋白質表面活性較差，從斷開二硫鍵入手可以大大改善蛋白質的表面活性。但是對于二硫鍵對蛋白質結構和表面活性的影響需要進一步加強研究。目前雖然在試驗上已經證實該方法的有效性，但是二硫鍵在分子水平上對蛋白質結構的影響尚不明確。近年來，隨著計算機技術的普及，分子動力學模擬研究分子微觀結構和功能的變化成為一種新的技術。相信今后的研究可以進一步將模擬和試驗結合，通過計算機模擬了解二硫鍵斷裂引起結構和表面活性變化的機理，然后通過模擬指導試驗、試驗驗證模擬的方式研究二硫鍵與結構和表面活性的關系，并能生產出具有更高表面活性的蛋白質類產品。

[1]蔡勇建，吳曉娟，吳偉，等.過氧自由基氧化對大豆蛋白功能性質影響[J].糧食與油脂，2013，8：13～16.

[2]黎陽.二硫鍵對胰島素聚集性的影響[碩士學位論文][D].湖北武漢：華中科技大學，2012：14～20.

[3]李軍生，李麗娜，陳海濤.通過打開蛋白質二硫鍵制備蛋白質基表面活性劑的方法：中國，200810166640，4[P].2012-02-18，http：//epub，sipo，gov，cn/patentoutline，action

[4]劉晶，蔡勇建，吳偉，等.丙二醛氧化對大豆蛋白功能性質的影響[J].中國油脂，2014，6：41～44.

[5]王朗，李軍生，閻柳娟，等.過氧乙酸氧化大豆蛋白工藝參數優化[J].食品工業科技，2013，22：213～216.

[6]王微，李軍生，閻柳娟，等.氧化變構-海藻酸鈉復合修飾對大豆分離蛋白表面活性的影響[J].飼料研究，2016，5：42～46，51.

[7]楊程，盧滇楠，張敏蓮，等.分子動力學模擬二硫鍵對胰島素構象穩定性的影響[J].化工學報，2010，4：929～934.

[8]張維農，劉大川.大豆分離蛋白H2O2氧化改性研究[J].中國油脂，2005，5：32～35.

[9]朱衛星，王遠亮，李宗軍.蛋白質氧化機制及其評價技術研究進展[J].食品工業科技，2011，11：483～486.

[10]Creighton T E，Disulphide bonds and protein stability[J].BioEssays，1988，8（2～3）：57～63.

[11]Gekko K，Kimoto A，Kamiyama T.Effects of disulfide bonds on compactness of protein molecules revealed by volume，compressibility，and expansibility changes during reduction[J].Biochemistry，2003，42（46）：13746～13753.

[12]Gekko K，Kimoto A，Kamiyama T.Effects of disulfide bonds on compactness of protein molecules revealed by volume，compressibility，and expansibility changes during reduction[J].Biochemistry，2003，42（46）：13746～13753.

[13]German J B，O’neill T E，Kinsella J E.Film forming and foaming behavior of food proteins[J].Journal of the American Oil Chemists’Society，1985，62（9）：1358～1366.

[14]Goldberg M E，Rudolph R，JAENICKE R.A kinetic study of the competition between renaturation and aggregation during the refolding of denatured-reduced egg white lysozyme[J].Biochemistry，1991，30（11）：2790～2797.

[15]Hirs C H W.The oxidation of ribonuclease with performic acid[J].Journal of Biological Chemistry，1956，219（2）：611～621.

[16]Kalapathy U，Hettiarachchy N S，Rhee K C.Effect of drying methods on molecular properties and functionalities of disulfide bond-cleaved soy proteins [J].Journal of the American Oil Chemists'Society，1997，74（3）：195～199.

[17]Kang Y N，Kim H，Shin W S，et al.Effect of Disulfide Bond Reduction on Bovine Serum Albumin‐Stabilized Emulsion Gel Formed by Microbial Transglutaminase[J].Journal of food science，2003，68（7）：2215～2220.

[18]Kella N K D，Barbeau W E，Kinsella J E.Effect of oxidative sulfitolysis of disulfide bonds of glycinin on solubility，surface hydrophobicity and in vitro digestibility[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，1986，34（2）：251～256.[19]Kella N K D，Kang Y J，Kinsella J E，Effect of oxidative sulfitolysis of disulfide bonds of bovine serum albumin on its structural properties：A physicochemical study[J].Journal of protein chemistry，1988，7（5）：535～548.

[20]Kella N K D，Yang S T，Kinsella J E，Effect of disulfide bond cleavage on structural and interfacial properties of whey proteins[J]，Journal of Agricultural and Food Chemistry，1989，37（5）：1203～1210.

[21]Kim S H，Kinsella J E.Surface active properties of food proteins：effects of reduction of disulfide bonds on film properties and foam stability of glycinin[J]. Journal of Food Science，1987，52（1）：128～131.

[22]Klemaszewski J L，Kinsella J E.Sulfitolysis of whey proteins：effects on emulsion properties[J]，Journal of agricultural and food chemistry，1991，39（6）：1033～1036.

[23]Klink T A，Woycechowsky K J，Taylor K M，et al.Contribution of disulfide bonds to the conformational stability and catalytic activity of ribonuclease A[J].European Journal of Biochemistry，2000，267（2）：566～572.

[24]Sanger F.Fractionation of oxidized insulin[J].Biochemical Journal，1949，44（1）：126.

[25]Snouwaert J N，Leebeek F W，Fowlkes D M.Role of disulfide bonds in biologic activity of human interleukin-6[J].Journal of Biological Chemistry，1991，266（34）：23097～23102.

[26]Thomas J A，Mallis R J.Aging and oxidation of reactive protein sulfhydryls[J].Experimental gerontology，2001，36（9）：1519～1526.

[27]Toennies G，Homiller R P.The oxidation of amino acids by hydrogen peroxide in formic acid[J].Journal of the American Chemical Society，1942，64（12）：3054～3056.

[28]Wu W，Hou L，ZhangG C，et al.Structural modification of soy protein by 13-hydroperoxyoctadecadienoic acid[J].European Food Research and Technology，2009，229（5）：771～778.

[29]Wu W，Wu X，Hua Y.Structural modification of soy protein by the lipid peroxidation product acrolein[J].LWT-Food Science and Technology，2010，43（1）：133～140.

[30]Wu W，Zhang C，Hua Y.Structural modification of soy protein by the lipid peroxidation product malondialdehyde[J]，Journal of the Science of Food and Agriculture，2009，89（8）：1416～1423.

[31]Wu W，Zhang C，Kong X，et al.Oxidative modification of soy protein by peroxyl radicals[J].Food Chemistry，2009，116（1）：295～301.

[32]Ye L，Liao Y，Sun W，et al.Effect of protein oxidation on the stability of peanut beverage[J].CyTA-Journal of Food，2015，13（1）：49～55.

[33]Ye L，Liao Y，ZhaoO M，et al.Effect of protein oxidation on the conformational properties of peanut protein isolate[J].Journal of Chemistry，2013，2013.

Protein is the foundation of all life，which contains many disulfide bonds，but the current research on the disulfide bonds is relatively less.In this paper，the disulfide bond inscape was simply introduced，the importance of disulfide bonds was analyzed from the perspective of effect on the structure and functional properties；the feasibility of the method of improving surface activity by cleaving disulfide bonds in the protein and advances in oxidation modification to improve protein surface activity in recent years were reviewed.

disulfide bond；protein；surface activity；oxidation modification

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20161702

S816

A

1004-3314（2016）17-0006-04

國家自然科學基金項目（21466006）；國家科技型中小企業技術創新項目（14C26214502814）；廣西科學研究與技術開發計劃項目（桂科能14122009-3-3、桂科轉14125006-30）；廣西高等學校高水平創新團隊及卓越學者計劃資助（桂教人〔2014〕7號）

*通訊作者