心臟內膜是苯并芘與α-萘黃酮的毒性靶點？

楊景峰，王豐，于華榮，于永利，魏素香，趙寶全，董武,*

1. 內蒙古民族大學動物科技學院/內蒙古自治區高等學校毒物與動物疾病監控重點實驗室，通遼 028000 2. 內蒙古民族大學農學院，通遼 028000 3. 內蒙古民族大學生命科學院，通遼028000 4. 路易斯維爾百奧生生物科技公司，美國德克薩斯州 5. 軍事醫學科學院毒物藥物研究所，北京 100850

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心臟內膜是苯并芘與α-萘黃酮的毒性靶點？

楊景峰1，王豐1，于華榮2，于永利3，魏素香4，趙寶全5，董武1,*

1. 內蒙古民族大學動物科技學院/內蒙古自治區高等學校毒物與動物疾病監控重點實驗室，通遼 028000 2. 內蒙古民族大學農學院，通遼 028000 3. 內蒙古民族大學生命科學院，通遼028000 4. 路易斯維爾百奧生生物科技公司，美國德克薩斯州 5. 軍事醫學科學院毒物藥物研究所，北京 100850

苯并芘(benzo-a-pyrene, BaP)是一種典型的致癌物質，具有一定的心血管毒性。試驗在形態學觀察的基礎上，檢測了細胞色素P450(CYP1A)在心臟的表達。結果表明雖然α-萘黃酮(ANF)沒有誘導，但BaP和BaP+ANF強烈誘導CYP1A的基因表達，以及在心臟內膜有強烈的蛋白質表達，在BaP與ANF同時染毒引起心臟水腫。說明心臟是BaP以及ANF的目標組織，進一步說明魚胚胎在藥物以及環境物質評價中的優勢。

BaP；胚胎；心臟；毒性

苯并芘(benzo-a-pyrene, BaP)和鹵代芳族烴如2,3,7,8-四氯-二苯-對-二惡英(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin, TCDD)等多環芳香烴(polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)廣泛存在環境中，其對有機體的生殖、發育和心血管均有一定的影響[1]。在美國，多環芳香烴的混合物(#7)，芘(#9)和benzo(b)fluroanthene(#10)等有害物質在環境法的優先級列表中(http://www.atsdr.cdc.gov/cercla/05list.html)。而相比之下鹵代烴，如多氯聯苯和有機氯農藥，在美國沉積物中有表明下降趨勢，但PAHs的濃度一直呈上升趨勢，尤其是城鎮附近的土地中[1]。α-萘黃酮(α-naphthoflavone, ANF)是一種實驗室常用的多環芳烴衍生物，作為部分AHR拮抗劑和CYP1A抑制劑。

有關BaP的毒性機理，被認為是經由芳香烴受體(AHR)介導，通過誘導CYP1A酶，代謝BaP而成為致突變和致癌代謝物[2-3]，最終表現為致癌作用。近年來多環芳烴也被認為是內分泌干擾物(endocrine disrupting compounds, EDCs)，具有降低有機體的繁殖能力的不良影響。體內和體外PAH染毒可導致排卵量、卵巢體細胞指數、17β-雌二醇水平以及卵黃原蛋白等指標的減少[4]。鳉魚(Fundulus heteroclitus)作為“首要的硬骨模型”在環境生物學中受到非常的重視[5]。鳉魚主要分布在河口，大西洋海岸線沿岸，它們保持著非常小的活動范圍[6]，在生殖和發育生物學已經得到認可[7-8]。鳉魚被廣泛地用于實驗室研究，用于進一步了解環境毒物的分子機制，包括但不僅限于多環芳烴[9-13]。

本研究以鳉魚為模型動物，給早期鳉魚胚胎染毒，探討BaP、ANF以及兩者合并染毒的形態學變化，及其毒性作用機理。

1 材料與方法 (Materials and methods)

1.1 藥物

苯并芘(benzo[a]pyren, BaP, 純度99%, 100 μg·L-1, 400 nmol·L-1溶于酒精中)，α-萘黃酮(alpha-naphthoflavone, ANF, 純度99%)，二甲基亞砜(純度>99.5%, DMSO)溶液等其他藥物均來源于Sigma公司(Sigma, St Louis, MO)。

1.2 試驗動物及染毒方式

鳉魚(Fundulus heteroclitus)飼養于玻璃容器中，水溫20 ℃，光照周期為14 h·d-1，受精后4.5 h，挑出發育正常的受精卵，放在10 mL的玻璃瓶中染毒。染毒濃度分別為：DMSO對照(0.1%，1 μg·L-1)，BaP (100 μg·L-1)，ANF (100 μg·L-1)和BaP (100 μg·L-1) + ANF (100 μg·L-1)，每種暴露濃度中含有5～10粒胚胎，每組進行3次平行實驗。暴露開始后，將鳉魚胚胎移入20 ℃孵化箱進行培養。各染毒組染毒48 h后更新染毒液，培養至實驗所需的發育時間，用于免疫組化、定量PCR(RT-PCR)和形態學觀察。

1.3 抗原-抗體反應

使用4%的中性緩沖多聚甲醛(PFA)將魚胚胎于4 ℃環境中固定24 h后進行常規石蠟包埋、切片、脫脂、梯度酒精脫水(100% I, 100% II, 95%, 90%, 80%和70%各2 min)，再經5～10 min流水清洗后，用10 mg·L-1蛋白酶K消化15 min，使用1%血清/PBTR(含1%Trito X-100的PBS)30 min封閉處理后與小鼠抗CYP1A單克隆抗體，在4 ℃環境中反應過夜。用緩沖液(PBTR)清洗后，滴加二抗(抗小鼠IgG抗體)放置在室溫反應2 h。用ABC KIT (Vectar Lab)發色，再使用甲基綠(methyl Green)進行相應的對比染色。

1.4 RNA的提取純化以及定量PCR(RT-PCR)技術

總RNA的制備將使用Trizol(Gibco產品)，使用手動或者勻漿儀打碎魚胚胎后者臟器后，加入氯仿并且離心，使之分為水相和有機相兩層。用移液槍轉移水相 (內含有RNA)，用異丙醇沉淀RNA，經80%乙醇洗滌2遍后用水(RNase free)溶解。制備好的RNA樣品用核酸定量分析儀檢測OD260、OD260/OD280的值，并計算RNA產量。根據不同需要，進行RNA的提純工作。轉錄使用反轉錄酶2 μL，5x Buffer 4 μL，5 mmoL·L-1dNTP加4 μL，反轉錄抑制劑1 μL，10X RT下游引物2 μL，模板5 μL，最后加DEPC水至20 μL。42 ℃、60 min后，在冰水中冷卻2 min備用。Sybr GreenI RT-PCR方法的建立：在25 μL，反應體系中，加入sybr GreenI PCR反應混合液12.5 μL，CYP1A上下游引物各1 μL，cDNA 1 μL (1 ng)，水9.5 μL。在95 ℃、10 min，然后95 ℃、15 s，60 ℃、1 min條件下反應40個循環。內參基因以及計算使用18 s，計算采用2-△△CT方法來計算基因表達的相對變化。

圖1 BaP和/或ANF(α-萘黃酮)對早期胚胎心臟的影響 注：鳉魚胚胎從4.5 hpf開始分別使用0、10 μg·L-1 ANF，100 μg·L-1 BaP以及10 μg·L-1 ANF + 100 μg·L-1 BaP染毒至10 dfp，觀察檢測心臟變化，箭頭表示心臟。Fig. 1 BaP and/or ANF (alpha naphthyl flavonoids) changed heart malphomation in fundulus embryosNote: Fundulus embryos were exposed to 0, 10 μg·L-1 ANF; 100 μg·L-1 BaP and 10 μg·L-1 ANF + 100 μg·L-1 BaP from 4 hpf until 10 dpf, observed heart malphomation. Arrow indicates heart.

1.5 數據統計與分析

試驗數據用SPSS統計軟件進行單因素方差分析方法進行多重比較，用平均值 ± 標準誤差表示，差異顯著性水平設置為 P<0.05。

2 結果(Results)

2.1 形態學的影響

許多環芳香烴(PAH)，如苯并芘(BaP)，是已知的致癌物質，最近也發現其具有嚴重的發育毒物。當使用BaP與α-萘黃酮(ANF)組合給鳉魚胚胎染毒時，引起鳉魚胚胎嚴重的心臟毒性，如血液凝塊、心包水腫和線狀心臟等。以往ANF作為CYP1A的競爭性抑制劑，用以減少BaP的毒性，但本實驗發現BaP與ANF聯合染毒誘導CYP1A基因表達以及蛋白質表達，誘導心臟細胞凋亡和心臟毒性。

試驗使用10 μg·L-1ANF、100 μg·L-1BaP以及10 μg·L-1ANF + 100 μg·L-1BaP染毒至10 dfp，結果表明對照組和ANF組沒有明顯的變化，雖然BaP組沒有明顯的變化，但是BaP+ANF染毒組出現嚴重的心囊水腫，心臟出現線條狀，呈繃緊狀態(圖1D和E)，通過ImageJ軟件分析心臟大小，發現BaP+ANF組心臟面積顯著變小(圖2)。

圖2 量化BaP和/或ANF對早期胚胎心臟面積的影響 注：鳉魚胚胎從4.5 hpf開始分別使用0、10 μg·L-1 ANF，100 μg·L-1 BaP以及10 μg·L-1 ANF + 100 μg·L-1 BaP染毒至10 dfp，測量心臟面積，n=10,不同數字間表示差異極顯著，P<0.05。Fig. 2 Quantitafication of the effect of BaP and/or ANF on heart area at embryo early stage Note: Fundulus embryos were exposed to 0, 10 μg·L-1 ANF; 100 μg·L-1 BaP and 10 μg·L-1 ANF + 100 μg·L-1 BaP from 4 hpf until 10 hpf, and observed heart area. Different letter indicate significant difference, P<0.05.

圖3 BaP和/或ANF對CYP1A基因表達的影響 注：鳉魚胚胎從4.5 hpf開始分別使用0、10 μg·L-1 ANF，100 μg·L-1 BaP以及10 μg·L-1 ANF + 100 μg·L-1 BaP染毒，至48 hpf和120 hpf收集提取RNA用于RT-PCR檢測。n=3 (每組10個魚卵)。Fig. 3 BaP and/or ANF affect CYP1A mRNA expression Note: Fundulus embryos were exposed to 0, 10 μg·L-1 ANF; 100 μg·L-1 BaP and 10 μg·L-1 ANF + 100 μg·L-1 BaP from 4 hpf until 48 hpf and 120 hpf, collect total RNA and carry out RT-PCR. n=3 (10 eggs/group).

圖4 BaP和/或ANF對早期胚胎心內膜CYP1A蛋白質表達的影響 注：鳉魚胚胎從4 hpf開始分別使用0、10 μg·L-1 ANF，100 μg·L-1 BaP以及10 μg·L-1 ANF + 100 μg·L-1 BaP染毒至120 hpf，實施固定、切片以及免疫染色。n=5，箭頭表示陽性反應的心臟內膜，** 心臟外膜。Fig. 4 BaP and/or ANF affect CYP1A protein expression in inner membrane at early stage embryos Note: Fundulus embryos were exposed to 0, 10 μg·L-1 ANF; 100 μg·L-1 BaP and 10 μg·L-1 ANF + 100 μg·L-1 BaP from 4 hpf until 120 hpf , carry out fix, sectioning and immunohistochemistry staining. n=5, arrow indicated inner membrane of heart and ** indicated out membrane of heart.

2.2 CYP1A表達的變化

實驗使用10 μg·L-1ANF、100 μg·L-1BaP以及10 μg·L-1ANF + 100 μg·L-1BaP給鳉魚染毒至48 hpf和120 hpf，收集魚卵提取整體RNA，之后轉錄為cDNA，使用18s作為看家基因進行對比，發現Bap在48 hpf誘導提高了214倍(圖3)。在120 hpf BaP誘導量進一步提升到452倍。BaP+ANF組在48 hpf高達1 585倍，但在120 hpf沒有48 hpf的高誘導量，但也達到693倍(P<0.05)(圖3)。至120 hpf，使用福爾馬林固定各組，進行脫水、包埋、切片，然手實施CYP1A免疫組織染色，結果表明在對照組和ANF染毒組，在心臟幾乎沒有陽性CYP1A反應，但在BaP染毒組可以清晰看到心臟內膜的褐色陽性反應，沒有在外膜發現(圖4C)，在BaP+ANF染毒組，CYP1A陽性反應表達不但在心臟內膜，在心臟外膜也同樣被發現(圖4D)。

3 討論(Discussion)

BaP是一種典型的PAHs化合物，有關“心臟是BaP的毒性靶器官”，在小鼠和大鼠實驗中沒有查到相關報道，但在魚類有類似的報道。如Gerger等[14]報道BaP給成年斑馬魚染毒后，發現心肌組織CYP1A mRNA表達顯著高于對照組，同時也高于在肝臟和骨骼肌內的表達，但沒有關于CYPA1A蛋白質水平的表達的報道。使用BaP給初期斑馬魚胚胎染毒，Incardona等[15]的報道與我們相似，不但BaP誘導幼魚形態學變化，也在基因水平強烈誘導CYP1A mRNA表達。在蛋白質水平，我們使用切片技術確認BaP誘導幼魚心臟內膜表達是首次報道。在本試驗中，進一步驗證BaP是一種強大CYP1A誘導劑。α-萘黃酮(α-naphthoflavone, ANF)本身雖然不能夠誘導CYP1A和毒性癥候群，但當BaP與ANF一同染毒時，并沒有文獻[16]報道那樣抑制CYP1A的誘導，反而極度顯著的在基因水平和蛋白質水平增加CYP1A，同時在形態學上表現為極度的心囊水腫。不同環數PAHs化合物對海水青鳉胚胎發育的毒性作用方式可能不同，但通過ANF抑制CYP1A誘導可分別導致Phe、Py和BaP對海水青鳉胚胎發育的毒性升高，二者呈潛在的協同作用徐增光等[17]報道小鼠染毒苯并(a)芘(BaP)9周過后，小鼠肺組織的CYP1A表達增加，但是隨著BaP劑量繼續增加，CYP1A表達量反而呈降低趨勢，表明低劑量BaP染毒誘導小鼠肺組織CYP1A mRNA表達，高劑量的BaP染毒則抑制CYP1A mRNA的表達，既在48 hpf出現BaP誘導的高表達CYP1A，但經連續染毒到120 hpf時候，CYP1A mRNA表達量反而比48 hpf低很多(圖3)。

在ANF的影響下，Phe、Py和BaP對EROD的誘導均不同程度的被抑制，但三者對胚胎的發育毒性卻均被提升，這果表明ANF與PAHs類化合物的聯合暴露并不是簡單的相加作用，而是具有潛在的協同作用，其毒性機制也較為復雜，并不完全符合DLCs作用方式；在實際環境中，部分PAHs化合物對CYP1A活性具有抑制性，表現為一種非競爭性的抑制劑(如熒蒽)。因此，本文部分證實了現有PHAs混合物毒性評價方法可能低估了實際環境中PAHs混合物毒性風險的結論。

通過本試驗表明，心臟是BaP的毒性靶器官，預示鳉魚作為實驗動物模型來檢測環境污染物質的可能性，高通量判斷環境污染程度具有重要意義。

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Heart is the Target Organ of BaP and Alpha Naphthyl Flavonoids？

Yang Jingfeng1, Wang Feng1, Yu Huarong2, Yu Yongli3, Wei Suxiang4, Zhao Baoquan5, Dong Wu1,*

1. Inner Mongolia Provincial Key Laboratory for Toxicants and Animal Disease, College of Animal Science and Technology, Inner Mongolia University for Nationalities, Tongliao 028000, China 2. College of Agriculture Science, Inner Mongolia University for Nationalities, Tongliao 028000, China 3. School of Life Science, Inner Mongolia University for Nationalities, Tongliao 028000, China 4. Bio-Synthesis, Inc.-DNA Lab Department, Lewisville, TX, USA 5. Institute of Pharmacology and Toxicology, Academy of Military Medical Science, Beijing 100850, China

Received 25 September 2015 accepted 11 November 2015

Benzo-a-pyrene (BaP) is a typical carcinogen, and has cardiovascular toxicity. We focused on heart morphological changes, cytochrome P4501A mRNA (CYP1A) expression and protein expression. In the heart, although the results showed that α-naphthoflavone (ANF) did not induce the expression of CYP1A mRNA, but CYP1A mRNA was strongly induced by BaP and BaP + ANF treatment, and CYP1A protein expression was also strongly induced in the inner membranes of heart. The results indicate that the heart is a target tissue of BaP and ANF, further illustrating the advantages of fish embryos for the evaluation of drugs and environmental substances.

BaP; embryos; heart; toxicity

10.7524/AJE.1673-5897.20150925001

國家自然科學基金(Nos. 21267015，81360508，21567019)；內蒙古自治區自然科學基金(Nos. 2012MS1203，2015MS0804)；草原英才工程項目(2015-2016)；內蒙古自治區高等學?？茖W研究項目(NJZY11202)；內蒙古民族大學科學研究基金資助項目(NMDGP1505)；內蒙古自治區科技創新引導項目(2015-2016)；人才開發基金項目(2014-2015)

楊景峰(1974-)，男，副教授，博士，研究方向為魚類生物技術，Email: yangjf@188.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: dongwu2002@hotmail.com

2015-09-25 錄用日期：2015-11-11

1673-5897(2016)2-394-05

X171.5

A

簡介：董武(1969—)，男，博士，碩導，主要從事環境毒理學研究，發表學術論文50余篇。

楊景峰, 王豐, 于華榮, 等. 心臟內膜是苯并芘與α-萘黃酮的毒性靶點？[J]. 生態毒理學報，2016, 11(2): 394-398

Yang J F, Wang F, Yu H R, et al. Heart is the target organ of BaP and alpha naphthyl flavonoids？ [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2016, 11(2): 394-398 (in Chinese)