VEGF、flk-1、bax、 bcl-2在不同類型DR大鼠模型視網膜組織中表達變化的觀察

董白霞，包永琴，王振東，王家瑤

(河北醫科大學第二醫院眼科，河北 石家莊 050000)

?

·論 著·

VEGF、flk-1、bax、 bcl-2在不同類型DR大鼠模型視網膜組織中表達變化的觀察

董白霞，包永琴，王振東，王家瑤

(河北醫科大學第二醫院眼科，河北 石家莊 050000)

目的觀察聯合注藥法建立的增殖型糖尿病性視網膜病變(proliferative diabetic retinopathy，PDR)大鼠模型視網膜組織中血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、flk-1、bax、bcl-2的表達變化，確定聯合注藥法所造大鼠PDR模型的價值。方法Sprague-Dawley大鼠分別采用鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)腹腔注射(單純注藥組)和STZ腹腔注射聯合VEGF玻璃體注射(聯合注藥組)制造糖尿病性視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)模型，應用免疫組織化學法測定不同時間點各模型組視網膜組織中VEGF、flk-1、bax、bcl-2的表達，應用MIAS1998型圖像分析系統測定VEGF、flk-1、bax、bcl-2在視網膜神經節細胞層和內網層的平均光密度值。結果單純注藥組、聯合注藥組VEGF、flk-1、bax、bcl-2在視網膜除視桿視錐層之外各層均有表達, 前三者在節細胞層和神經纖維層表達最強； bcl-2視桿視錐層內節最強； VEGF表達次強為Müller細胞；bcl-2表達次強為節細胞層和神經纖維層。但所有指標聯合注藥組表達強度大于單純注藥組。bcl-2單純注藥組8周時間點比2周時間點在節細胞層和神經纖維層表達增強;單純注藥組8周時間點在內網層的表達最強。聯合注藥組2周時間點節細胞層和神經纖維層表達最強。結論聯合注藥法建立的DR大鼠模型較單純注藥組更能夠代表人類PDR的病理改變，具有一定的科研價值。

糖尿病視網膜病變；血管內皮生長因子類；大鼠

前期研究對鏈脲佐菌素(Streptozotocin, STZ)腹腔注射誘發的SD(Sprague-Dawley)大鼠糖尿病性視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)模型(單純注藥組)和STZ腹腔注射聯合血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)玻璃體注射建立的增殖型糖尿病性視網膜病變(proliferative diabetic retinopathy，PDR)模型(聯合注藥組)熒光素眼底血管造影(fluorescence fundus angiography,FFA)、碳素顆粒在視網膜微血管系統的滲漏情況、CD105免疫組織化學標記增殖的血管內皮細胞、電鏡下視網膜組織超微結構損害程度等方面進行了系列觀察和比較，發現單純注藥組僅能模擬人類背景期DR的病理損害；而聯合注藥組則能夠代表人類PDR，探索了一種全新的PDR動物模型[1]。為進一步確定此模型在蛋白質和分子水平的變化是否能反映DR的病理過程，擬研究VEGF、flk-1在上述2種模型大鼠視網膜組織中的表達。糖尿病時視網膜神經細胞以凋亡的形式死亡，故采用免疫組織化學法研究凋亡相關基因bax和bcl-2在不同DR大鼠模型視網膜中的表達，以確定聯合注藥組模型有無科研價值?，F報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要試劑 8周齡健康SD大鼠，雌雄各半，體質量180～250 g。購自河北省實驗動物中心。VEGF蛋白購自美國Sigma公司；VEGF、flk-1、bax、bcl-2一抗購自博士德公司；PV-6001/6002免疫組織化學試劑盒購自北京中杉公司。

1.2 方法 STZ(60 mg/kg)腹腔注射制造DR大鼠模型24只。 1個月后 VEGF 0.05 μg/2 μL雙眼玻璃體注射12只(聯合注藥組)，等量生理鹽水雙眼玻璃體注射12只(單純注藥組)。按析因設計的實驗研究方法，分為造模方法(單純注藥法、聯合注藥法)和病程(玻璃體注射VEGF后2周、4周、8周)2個因素。將各個因素的各個水平間排列組合，交叉分組，共6種組合，每種組合選4只動物。每組每個時間點分別處死4只動物，取材雙眼球標本，做視網膜組織切片，行VEGF、flk-1、bax、bcl-2免疫組織化學染色檢查。

1.3 計算機圖像分析 每只鼠每只眼球隨機選取視網膜切片2張，每張隨機選5個視野，應用MIAS1998型圖像分析系統(河北醫科大學第三醫院實驗中心)測定VEGF、flk-1、bax、bcl-2在節細胞層、內網層的平均光密度值，所測數據應用析因設計的單因素方差分析對造模方法和病程對上述4種指標表達的影響進行研究，明確造模方法和病程對其表達影響的作用大小。

2 結 果

2.1VEGF在各組的表達情況

2.1.1 光學顯微鏡觀察 單純注藥組、聯合注藥組VEGF在視網膜除視桿視錐層之外各層均有表達, 節細胞層和神經纖維層表達最強; 其次為Müller細胞(圖1，2)。但聯合注藥組強度大于單純注藥組。

2.1.2VEGF在節細胞層和內網層表達強弱程度與造模方法、不同病程的關系分析 不同造模方法和病程對VEGF在節細胞層及內網層表達的影響差異均有統計學意義,且兩者之間有交互作用。造模方法對VEGF表達影響的作用遠大于病程的影響，聯合注藥法與單純注藥法相比，在2周病程對VEGF在內網層表達的影響差異有統計學意義(P<0.05)；在4周、8周病程對VEGF在節細胞層和內網層表達的影響差異均有統計學意義(P<0.05)。2周與4周相比,VEGF在內網層表達差異有統計學意義(P<0.05)。其余差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1，2。

表1VEGF在各組神經節細胞層表達的光密度值

造模方法造模后不同時間點2周4周8周單純注藥組 0.29±0.060.25±0.030.33±0.04聯合注藥組 0.33±0.050.39±0.040.38±0.02A因素(方法)F=40.890 P=0.000B因素(病程)F=4.400 P=0.019交互作用 F=7.460 P=0.002

表2 VEGF在各組內網層表達的光密度值

造模方法造模后不同時間點2周4周8周單純注藥組 0.19±0.020.14±0.020.17±0.02聯合注藥組 0.29±0.020.28±0.020.22±0.03A因素(方法)F=262.020 P=0.000B因素(病程)F=18.610 P=0.000交互作用 F=17.410 P=0.000

2.2 flk-1在各層的表達 情況

2.2.1 普通光學顯微鏡觀察 flk-1在2個模型組視網膜除視桿視錐層外節以外各層均表達, 節細胞層和神經纖維層表達最強(圖3，4)。但聯合注藥組強度大于單純注藥組。

2.2.2 flk-1在節細胞層和內網層表達強弱程度與造模方法、不同病程的關系分析 造模方法對flk-1在神經節細胞層和內網層表達的影響差異有統計學意義(P<0.05), 病程對flk-1在神經節細胞層和內網層表達的影響差異無統計學意義(P>0.05),但兩者之間有交互作用。造模方法對flk-1在節細胞層表達的影響遠大于病程的影響，在2周、8周病程不同造模方法對flk-1在節細胞層表達的影響差異有統計學意義(P<0.05),在4周病程對flk-1在節細胞層表達的影響差異無統計學意義(P>0.05)。見表3，4。

表3 flk-1在各組神經節細胞層表達的光密度值

造模方法造模后不同時間點2周4周8周單純注藥組 0.28±0.040.35±0.030.24±0.04聯合注藥組 0.43±0.060.35±0.040.44±0.05A因素(方法)F=87.890 P=0.000B因素(病程)F=0.670 P=0.518交互作用 F=22.130 P=0.000

表4 flk-1在各組內網層表達的光密度值

造模方法造模后不同時間點2周4周8周單純注藥組 0.15±0.010.25±0.010.17±0.03聯合注藥組 0.35±0.060.27±0.040.36±0.01A因素(方法)F=210.290 P=0.000B因素(病程)F=0.793 P=0.459交互作用 F=43.130 P=0.000

2.3 bax在各組的表達情況

2.3.1 普通光學顯微鏡觀察 bax在2個模型組視網膜除視桿視錐層外節以外各層均表達, 節細胞層和神經纖維層表達最強(圖5，6)。但聯合注藥組強度大于單純注藥組。

2.3.2 bax在節細胞層和內網層表達強弱程度與造模方法、不同病程的關系分析 造模方法和病程對bax在神經節細胞層及內網層表達的影響差異有統計學意義(P<0.05),且兩者之間有交互作用。造模方法對bax表達影響的作用遠大于病程的影響，不同造模方法相比，在2周、4周、8周病程對bax的表達的影響差異均有統計學意義(P<0.05)。2周與4周、4周與8周相比, bax的表達差異均有統計學意義(P<0.05)。VEGF玻璃體腔注射后4周內對bax表達影響的作用大于造模方法的影響，不同造模方法相比，在2周、4周、8周病程對bax的表達的影響差異均有統計學意義(P<0.05)。2周與4周相比, bax的表達差異有統計學意義(P<0.05)。見表5，6。

2.4 bcl-2在各層的表達

2.4.1 普通光學顯微鏡觀察 bcl-2在兩模型組視網膜除視桿視錐層外節以外各層均表達, 視桿視錐層內節最強, 節細胞層和神經纖維層次之(圖7)。單純注藥組8周時間點比2周時間點在節細胞層和神經纖維層表達增強;單純注藥組8周時間點在內網層的表達最強。聯合注藥組2周時間點節細胞層和神經纖維層表達最強(圖8)。

2.4.2 bcl-2在節細胞層和內網層表達強弱程度與造模方法、不同病程的關系分析 各組間 bcl-2在節細胞層及內網層表達的光密度值差異有統計學意義(P<0.05)。bcl-2在糖尿病病程2周與8周、2周與4周、4周與8周差異均有統計學意義(P<0.05)。見表7，8。

表5 bax在各組神經節細胞層表達的光密度值

造模方法造模后不同時間點2周4周8周單純注藥組 0.27±0.010.34±0.030.44±0.02聯合注藥組 0.42±0.010.42±0.030.47±0.03A因素(方法)F=124.390 P=0.000B因素(病程)F=82.370 P=0.000交互作用 F=24.310 P=0.000

表6 bax在各組內網層層表達的光密度值

造模方法造模后不同時間點2周4周8周單純注藥組 0.20±0.030.31±0.020.28±0.02聯合注藥組 0.27±0.010.28±0.010.34±0.01A因素(方法)F=31.320 P=0.000B因素(病程)F=65.000 P=0.000交互作用 F=25.480 P=0.000

表7 bcl-2在各組神經節細胞層表達的光密度值

造模方法造模后不同時間點2周4周8周單純注藥組 0.22±0.020.26±0.020.35±0.02聯合注藥組 0.50±0.070.22±0.010.29±0.05A因素(方法)F=30.393 P=0.000B因素(病程)F=41.105 P=0.000交互作用 F=98.348 P=0.000

表8 bcl-2在各組內網層表達的光密度值

造模方法造模后不同時間點2周4周8周單純注藥組 0.14±0.010.21±0.010.40±0.03聯合注藥組 0.47±0.080.24±0.010.28±0.05A因素(方法)F=41.933 P=0.000B因素(病程)F=35.029 P=0.000交互作用 F=125.605 P=0.000

3 討 論

3.1 VEGF和flk-1表達的變化 VEGF是DR中造成微血管病變的重要因子，在DR的發生發展過程中起至關重要的作用。前期研究表明，糖尿病時VEGF在視網膜的表達隨病程進展逐漸增加，其特異性酪氨酸激酶受體——flk-1的表達也隨病程進展逐漸增強[2-3]。

為了進一步明確前期所建立的PDR動物模型(聯合注藥組)在細胞因子及蛋白質水平表達的變化，本研究觀察了該模型大鼠的視網膜組織VEGF和flk-1表達的變化，并應用相互對照、析因設計的實驗方法，與目前廣泛采用的STZ誘發的糖尿病大鼠模型(單純注藥組)的表達結果進行了比較。結果顯示：聯合注藥法較單純注藥法對于VEGF和flk-1在視網膜節細胞層的表達強度有影響；在注射VEGF后4、8周聯合注藥組與單純注藥組大鼠視網膜節細胞層VEGF的表達光密度值的差異有統計學意義(P<0.05)，在VEGF注射后4、8周，聯合注藥組較單純注藥組VEGF表達增強；在注射VEGF后2、8周2組大鼠視網膜節細胞層flk-1表達的光密度值的差異有統計學意義(P<0.05)，在注射VEGF后2、8周，聯合注藥組較單純注藥組flk-1表達增強；聯合注藥組大鼠視網膜VEGF表達增強出現在VEGF注射后第4、8周，而flk-1增強則出現在VEGF注射后第2、8周。分析原因可能是：聯合注藥組玻璃體注射外源性VEGF后抑制了視網膜自身內源性VEGF的分泌，而外源性VEGF因不液化的玻璃體的因素，經視網膜完全吸收需要一定的時間。造模方法和病程對內網層VEGF表達的影響差異均有統計學意義(P<0.05),且兩者之間有交互作用。造模方法對VEGF表達影響的作用遠大于病程的影響，在注射VEGF后2、4、8周時，聯合注藥組與單純注藥組大鼠相比，VEGF表達的光密度值增加差異有統計學意義； 隨病程進展，在注射VEGF后4周VEGF表達的光密度值降低，差異有統計學意義。出現上述結果的原因是：內網層位于節細胞層的內層，2周時外源性VEGF尚未經視網膜充分吸收，對內網層內源性VEGF的表達還沒有造成一定的影響，而在4周時節細胞層VEGF表達增強，內網層表達受抑制，因此出現了4周時內網層VEGF表達減弱的現象。在注射VEGF后2、8周時，聯合注藥組大鼠視網膜內網層flk-1表達的光密度值均高于相同病程的單純注藥組大鼠。表明聯合注藥組與單純注藥組相比，視網膜節細胞層和內網層VEGF的表達增加，注射VEGF后4周時內網層VEGF的表達較2周時減少，這與外源性藥物在相鄰組織吸收后對內源性分泌的抑制有關。伴隨著VEGF在注射后4周表達的減少，其特異性flk-1受體的表達也無增加的趨勢，直到8周時才增高，二者變化趨勢是一致的。

3.2 促凋亡基因bax和抑凋亡基因bcl-2表達的變化 bcl-2基因抑制細胞凋亡的發生[4],對視網膜細胞有保護作用和抑制凋亡的作用[5-6]。bax是bcl-2的同種性蛋白，在細胞凋亡中所起的作用卻相反，二者之間的比例決定了細胞的命運是生存還是凋亡[7-8]。bax在糖尿病大鼠[9-10]和人[11]視網膜的表達增加。而bcl-2的改變，存在一些爭議：Drel等[12]發現，STZ誘導的大鼠視網膜血管周細胞表達bcl-2降低；糖尿病患者的視網膜Muller細胞表達bcl-2降低[13-14]； Shin等[15]發現糖尿病患者神經視網膜表達bcl-2增加；Cai等[16]則發現視網膜血管內皮細胞表達bcl-2先增加后降低。

不同造模方法和病程對神經節細胞層和內網層bax表達的影響差異均有統計學意義,且兩者之間有交互作用。造模方法對節細胞層bax表達影響的作用遠大于病程的影響：在注射VEGF后2、4、8周時，聯合注藥組與單純注藥組大鼠視網膜節細胞層bax表達的光密度值差異有統計學意義。聯合注藥組表達強于單純注藥組。隨病程進展，糖尿病大鼠視網膜節細胞層bax表達的光密度值不斷增高，一直持續至注射VEGF后8周。而在內網層則不然，注射VEGF后4周內時間對bax表達影響的作用大于造模方法的影響。注射VEGF后2、4、8周時，2組內網層bax表達的光密度值的差異均有統計學意義。注射VEGF后2、8周時，聯合注藥組較單純注藥組bax表達增高；注射VEGF后4周時聯合注藥組較單純注藥組bax表達降低。這表明VEGF影響了bax的表達。注射VEGF后4周內，bax的表達隨病程進展增強，這種增強主要與病程有關，而非聯合注藥的作用。

各組間 bcl-2在節細胞層和內網層表達的光密度值差異均有統計學意義。bcl-2在糖尿病病程2周與8周、2周與4周、4周與8周的差異均有統計學意義(P<0.05)。上述結果表明，注射VEGF后8周內，隨病程進展，2個模型組大鼠節細胞層和內網層bcl-2的表達漸增強； 聯合注藥組在4周時其表達較2周時有所減弱，說明外源性VEGF的注入在短期內可使視網膜組織內保護性因子bcl-2的表達增加；隨DR病程進展，糖尿病大鼠視網膜內層bcl-2的表達增加，外源性VEGF則在短期內使得bcl-2的表達增加。

綜上所述，DR時視網膜神經細胞有保護作用的bcl-2基因蛋白在視網膜內層的表達增加，這可能是機體對視網膜細胞損傷的一種代償性保護機制。(本文圖見封三)

[1] Rajashekhar G,Ramadan A,Abburi C,et al. Regenerative therapeutic potential of adipose stromal cells in early stage diabetic retinopathy[J]. PLoS One，2014，9(1):e84671.

[2] 董白霞，高福祿，龐曉靜.糖尿病小鼠血管內皮生長因子表達與血糖、病程的關系[J].中華眼底病雜志，2000,16(3)：182-183.

[3] 董白霞,高福祿,張愛子,等.血管內皮生長因子及其受體在糖尿病小鼠視網膜的表達[J].解剖學雜志，2001,24(5)：421-424.

[4] Yoo SH,Yoon YG,Lee JS,et al. Etoposide induces a mixed type of programmed cell death and overcomes the resistance conferred by Bcl-2 in Hep3B hepatoma cells[J]. Int J Oncol,2012,41(4):1443-1454.

[5] Fr?hlich M,Jaeger A,Weiss DG,et al. Inhibition of BCL-2 leads to increased apoptosis and delayed neuronal differentiation in human ReNcell VM cells in vitro[J]. Int J Dev Neurosci,2016,48(2):9-17.

[6] Martínez-Moreno CG,vila-Mendoza J,Wu Y,et al. Neuroprotection by GH against excitotoxic-induced cell death in retinal ganglion cells[J]. Gen Comp Endocrinol,2016,234:68-80.

[7] Meichner K,Fogle JE,English L,et al. Expression of Apoptosis-regulating Proteins Bcl-2 and Bax in Lymph Node Aspirates from Dogs with Lymphoma[J]. J Vet Intern Med,2016,30(3):819-826.

[8] Banerjee M,Chattopadhyay S,Choudhuri T,et al. Cytotoxicity and cell cycle arrest induced by andrographolide lead to programmed cell death of MDA-MB-231 breast cancer cell line[J]. J Biomed Sci,2016,23:40.

[9] Yang J,Wang T,Zhang Y,et al. Altered expression of mitofusin 2 in penile tissues of diabetic rats[J]. Andrologia,2014,46(5):522-528.

[10] Zeng K,Wang Y,Yang N,et al. Resveratrol Inhibits Diabetic-Induced Müller Cells Apoptosis through MicroRNA-29b/Specificity Protein 1 Pathway[J]. Mol Neurobiol，2016[Epub ahead of print].

[11] Hao M,Li Y,Lin W,et al. Estrogen prevents high-glucose-induced damage of retinal ganglion cells via mitochondrial pathway[J]. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol，2015，253(1):83-90.

[12] Drel VR,Pacher P,Ali TK,et al. Aldose reductase inhibitor fidarestat counteracts diabetes-associated cataract formation,retinal oxidative-nitrosative stress,glial activation,and apoptosis[J]. Int J Mol Med,2008,21(6):667-676.

[13] Wu M,Yang S,Elliott MH,et al. Oxidative and Endoplasmic Reticulum Stresses Mediate Apoptosis Induced by Modified LDL in Human Retinal Müller Cells[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci,2012,53(8):4595-4604.

[14] Han N,Yu L,Song Z,et al. Agmatine protects Müller cells from high-concentration glucose-induced cell damage via N-methyl-D-aspartic acid receptor inhibition[J]. Mol Med Rep,2015,12(1):1098-1106.

[15] Shin ES,Huang Q,Gurel Z,et al. STAT1-mediated Bim expression promotes the apoptosis of retinal pericytes under high glucose conditions[J]. Cell Death Dis,2014,5(1):e986.

[16] Cai J,Ahmad S,Jiang WG,et al. Activation of vascular endothelial growth factor receptor-1 sustains angiogenesis and bcl-2 expression via the phosphatidylinositol 3-kinase pathway in endothelial cells[J]. Diabetes，2003,52(12):2959-2968.

(本文編輯：趙麗潔)

Observation of the expression of VEGF, flk-1, bax and bcl-2 in the retina of different types of DR rat model

DONG Bai-xia， BAO Yong-qin， WANG Zhen-dong， WANG Jia-yao

(Department of Ophthalmology， the Second Hospital of Hebei Medical University， Shijiazhuang 050000， China)

Objective To observe the variation of vascular endothelial growth factor(VEGF)， flk-1， bax， bcl-2 expression in PDR rat retina eatablished by symphysial injection and to definite its superiority. Methods Sprague-Dawley rats were made as diabetic retinopathy models by solitary injection with streptozotocin intraperitoneally or symphysial injection with streptozocin intraperitoneally and VEGF intravitreously respectively. Using factorial design empirical method，we observed the variation of VEGF， flk-1， bax， bcl-2 expression in retinas of diabetic rats established by different methods by immunohistochemistry and measured the average optical density value of VEGF， flk-1， bax， bcl-2 in retinal ganglion cell layer and inner plexiform layer by MIAS1998 type image analysis system. Results VEGF，flk-1， bax， bcl-2 were expressed in each layer of retina in both groups except the layer of rods and cones. The front three targets were expressed strongest in the ganglion and nerve fiber layer, while bcl-2 was expressed the strongest in inner segment of the rods and cones layer. The next strongest layer of VEGF expression was the Müller cells while the next strongest layer of bcl-2 expression was the ganglion and nerve fiber layer. All targets expression in symphysial injection groups were stronger than those in solitary injection groups. Bcl-2 expression in ganglion and nerve fiber layer at 8 weeks after VEGF injection was stronger than that at 2 weeks. The strongest bcl-2 expression was in inner plexiform layer at 8 weeks in solitary injection groups, while in symphysial injection groups it was in ganglion and nerve fiber layer at 2 weeks after VEGF injection. Conclusion PDR rat model established by symphysial injection can represent the pathological changes of human PDR and has its scientific research worth.

diabetic retinopathy； vascular endothelial growth factors； rats

2016-07-07；

2016-09-06

董白霞(1975-)，女，河北河間人，河北醫科大學第

R587.26

A

1007-3205(2016)11-1289-06

10.3969/j.issn.1007-3205.2016.11.013

二醫院副主任醫師，醫學博士，從事眼外傷、眼底病診治研究。