HPLC法測定不同產地爬山虎莖中白藜蘆醇的含量

鮑慧瑋++侯曉琳++劉芳馨++張晨++劉佳

【摘要】目的：建立一種測定爬山虎莖中白藜蘆醇含量的方法，并對不同產地的爬山虎進行測定。方法：使用Agilent TC-C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動相：甲醇-水（45∶55）；柱溫：35℃；體積流速：1mL/min；檢測波長：290nm；進樣量均為10μL。結果：爬山虎中白藜蘆醇的進樣量在0.002168～0.03252mg/mL范圍內呈良好的線性關系，平均回收率為101.2%，RSD值為0.84%，且精密度、穩定性、重復性均良好。結論：該方法可以精密、快速、穩定和高效的測定爬山虎中白藜蘆醇的含量。

【關鍵詞】爬山虎莖；白藜蘆醇；含量測定；HPLC

【中圖分類號】R284.2【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2016）21-0017-03

Determination of Resveratrol in Different Areas of Boston Ivy Stem by HPLC

BAO HuiweiHOU XiaolinLIU FangxinZHANG ChenLIU Jia*

Changchun University of Chinese Medicine， Changchun 130117， China

Abstract： Objective To establish a method for the determination resveratrol in Boston ivy stem in different places. Methods The chromatographic column： Agilent TC-C18 （4.6mm×250mm， 5μm）； The mobile phase： methanol-water（45∶55）； The column temperature： 35℃； The volumetric flow rate： 1mL/min； The UV detector was set at 290nm； The sample size： 10μL. Results Resveratrol showed good liner relation when the content was during 0.002168mg/mL～0.03252mg/mL in the samples， the average recovery was 101.2%， RSD=0.84%， good stability， precision and repeatability； Conclusion This method can determine the contents of trans-resveratrol in Boston ivy stem， it is fast， accurate and stable.

Keywords：Boston Ivy Stem； Resveratrol；Content Determination； HPLC

爬山虎（Parthenocissus tricuspidata S. Z.）系葡萄科爬山虎屬落葉多年生多分枝木質大藤本，又名地錦、爬墻虎[1-2]。爬山虎莖長10～30m，枝端卷須可發育成粘性吸盤有很強的吸附、攀援能力，可攀援光滑的墻壁和裸露的巖石[3]，具有良好的生態適應性，是裝飾墻壁、 假山的園林植物。近年來，人們對其黏附、繁殖以及綠化方面的研究較多，其同樣具有良好的藥效作用，如在抑菌[4]、抗氧化[5]等方面。爬山虎中藥用活性成分較多，包括多糖、紅色素、多酚類、黃酮類成分等，其中白藜蘆醇在抗血栓[6]、抗腫瘤[7]、改善和治療心血管疾病中起著重要的作用[8-10]，其結構見圖1，且白藜蘆醇在自然界中更加穩定，藥效較順式更強，從爬山虎中分離白藜蘆醇也成為其獲得方法之一[11]。鑒于爬山虎較高的藥用價值，卻缺少質量控制方法，本研究利用HPLC法建立一種測定爬山虎中白藜蘆醇的方法，以評價不同產地的爬山虎[12]。

1儀器與材料

1.1儀器安捷倫1260型液相色譜儀（美國安捷倫有限公司）；AVW20D型電子天平（日本島津制作所）；RE 52-99旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；KQ-400KDE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2材料反式白藜蘆醇對照品（批號：111535-200502，中國藥品生物制品檢定所）；甲醇（色譜純，美國FISHER公司），乙醇、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、石油醚（分析純，北京化工廠），水（純凈水，杭州娃哈哈集團有限公司）。樣品經長春中醫學院李波老師鑒定為葡萄科爬山虎屬落葉多年生多分枝木質大藤本植物爬山虎莖（Parthenocissus tricuspidata S. Z.），來源及批號見表1。

2方法與結果

2.1色譜條件與系統適應性試驗[7] 色譜柱：Agilent TC C18柱（4.6mm×150mm，5μm）；流動相：甲醇-水（45∶55）；柱溫：35℃；體積流速：1mL/min；檢測波長為290nm；進樣量均為10μL。理論塔板數按白藜蘆醇計算均不低于1500。在此條件下，白藜蘆醇與其他物質分離度均符合藥典規定，白藜蘆醇標準品和爬山虎莖供試品色譜圖見圖2、圖3。

2.2對照品溶液的配制精密稱取白藜蘆醇對照品10.22mg，置1000mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制備成0.01022mg/mL的白藜蘆醇對照品溶液。

2.3供試品溶液的配制將干燥的爬山虎莖粉碎，過60目篩，精密稱定10.5g，加200mL的乙酸乙酯超聲提取約20min，過濾，在藥渣中加入200mL乙酸乙酯超聲提取約20min，過濾，并用200mL乙酸乙酯洗滌藥渣，合并乙酸乙酯提取液，旋蒸60℃蒸干，用色譜甲醇溶解并用定容于10mL容量瓶中。

2.4線性關系考察精密稱取白藜蘆醇對照品10.84mg，置100mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別吸取0.2、0.6、1、1.5、2、3ml，置于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻。即濃度為0.002168、0.006504、0.01084、0.01626、0.02168、0.03252mg/mL的線性關系對照品溶液。按照“2.1”方法，分別注入高效液相色譜儀，記錄色譜峰面積。以色譜峰面積（Y）對溶液濃度（X）作圖，得到白藜蘆醇的回歸方程為Y=31552X+6.2003，r=0.9995（n=6），表明白藜蘆醇在0.002168～0.03252mg范圍內呈良好的線性關系。

2.5精密度試驗按照“2.1”項下方法分別精密吸取對照品溶液和爬山虎供試品溶液（批號為20150801）各10μL，重復進入高效液相色譜儀6次，測得白藜蘆醇對照品和供試品色譜峰面積的RSD值分別為1.79%和1.82%，結果表明此方法精密度良好。

2.6穩定性考察分別在0、2、4、6、8、10、12、24h時，按照“2.1”項下方法分別精密吸取對照品溶液和爬山虎莖供試品溶液（批號為：20150601）10μL，依次進樣，測得白藜蘆醇對照品和爬山虎供試品色譜峰面積的RSD值分別為1.65%和1.01%（n=8），結果表明供試品溶液中白藜蘆醇和對照品在24h內穩定。

2.7重復性實驗取爬山虎莖供試品（批號：20150601）6份，每份約10g，精密稱定，按“2.3”項下制備供試品溶液，依法進行含量測定，測得白藜蘆醇色譜峰面積，并計算出其含量的RSD值為1.95%，結果表明此方法重復性良好。

2.8加樣回收率實驗取白藜蘆醇對照品6份，每份約10mg，定容至100mL容量瓶中，吸取0.5mL，分別加入6份約5g的爬山虎莖供試品（批號：20150601），按“2.3”項下制備供試品溶液，并進行含量測定，計算回收率。結果白藜蘆醇的平均回收率為101.2%，RSD值為0.84%（n=6），表明此方法回收率良好。結果見表2。

2.9樣品測定取不同產地爬山虎樣品，按照“2.3”項下制備供試品溶液，分別精密吸取“2.2”項下對照品溶液和供試品溶液，注入液相色譜儀器中，依法進行含量測定，記錄色譜峰面積，并按照外標法計算供試品中白藜蘆醇的含量。結果見表3。

3討論

3.1提取方法的考察分別考察超聲提取法、回流提取法對爬山虎中白藜蘆醇的提取，發現兩種方法均有很好的提取效果。但是回流提取法需要提取時間較長，且其液相色譜圖雜質峰較多，故選取超聲提取法對爬山虎進行提取。通過對比甲醇、乙醇、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、石油醚等試劑對爬山虎的提取結果，發現除石油醚外，提取效果均很好，但其中乙酸乙酯色譜圖中干擾主峰的雜質最少，最利于白藜蘆醇的分離和測定。

3.2流動相的考察選擇甲醇-水和乙腈-水體系對白藜蘆醇進行分離，不斷的改變有機相和水相的比例，最終確定甲醇-水（45∶55）為最佳分離比例，可將白藜蘆醇和其它物質很好的分離開，且分離時間較短，峰形良好。

3.3檢測波長的考察因爬山虎莖中成分極其復雜，故通過二極管全波長陣列檢測器對供試品在190～400nm波長下進行分析，發現在290nm下，白藜蘆醇吸收較好，且在此波長下其與爬山虎中其它組分分離度良好。

爬山虎雖然是一種具有良好藥效的藥材，但人們往往對于其爬墻能力方面研究較多，對于其藥用價值方面研究較少。通過對其成分的分離，發現其中含有較高含量的白藜蘆醇。白藜蘆醇具有良好的抗腫瘤活性和治療心血管疾病等藥效作用，來近些年來備受人們關注，市場的需求也日益增加。由于爬山虎價格低廉，且生長速度極其迅速，從爬山虎莖中提取、分離反式白藜蘆醇也是一種可行的方法。白藜蘆醇的含量直接影響其質量，故測定其中白藜蘆醇的含量非常重要。本研究建立了一種精密、快速、穩定、高效的HPLC測定方法，測定不同產地爬山虎莖中白藜蘆醇的含量，建立了一種可靠的質量評定方法，此方法為其質量控制奠定了研究基礎。

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（編輯：陶希睿）