加蘭他敏合成途徑的研究進展

周日寶，劉暢宇，彭美晨，王朝暉，劉湘丹*

（湖南中醫藥大學藥學院，湖南長沙410208）

加蘭他敏合成途徑的研究進展

周日寶，劉暢宇，彭美晨，王朝暉，劉湘丹*

（湖南中醫藥大學藥學院，湖南長沙410208）

加蘭他敏是一種廣泛用于治療阿爾茨海默氏癥等疾病的藥物，但研究發現，植物中加蘭他敏含量極少，故科研人員一直致力于加蘭他敏的合成研究。迄今為止，研究工作者已提出多種加蘭他敏化學合成策略，但因其化學合成方法存在產率低、成本高、步驟復雜等諸多缺陷，不利于投入實際生產，探索其生物合成途徑是目前最有效替代辦法。本文綜述了近年來加蘭他敏合成的相關研究，且著重介紹了其生物合成途徑及其相關酶研究進展，并對其后續研究進行展望。

加蘭他敏；生物合成途徑；關鍵酶；基因調控；石蒜

加蘭他敏(galanthamine，C17H21NO3），即雪花蓮胺堿（lycoremine)，又名強肌寧、尼瓦林[1]，具有選擇性和可逆性調節煙堿型乙酰膽堿受體及抑制乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AchE）的雙重作用。加蘭他敏易于通過血腦屏障進入腦組織，對中樞神經作用較強[2-3]，主要用于治療記憶和認知功能方面疾病，對輕度或中度阿爾茨海默氏癥（Alzheimer’s disease，AD）有很好的療效，對早期至中期的AD臨床治愈性達50～60%，與其他幾種治療AD的乙酰膽堿酯酶抑制劑相比，具有治療范圍廣、毒副作用小、耐受性好等優點[4-5]。自1952年蘇聯首次從沃氏雪花蓮(Galanthus woronawii Losink)的鱗莖中分離出來以后，加蘭他敏一直作為藥用價值較高的有效成分被廣泛研究，1996年，其首次作為AchE抑制劑類藥物于奧地利上市，后陸續作為治療不同程度AD的藥物獲歐盟批準，并于2001年獲美國FDA許可治療AD。在目前全球老年人口增多，AD患者人數呈成倍增長的趨勢下，加蘭他敏作為一種療效好、不良反應輕微、優勢明顯的中樞膽堿酯酶抑制劑[6-8]，越發受到重視，并漸漸成為治療AD的首選藥物之一[4-8]。其次，加蘭他敏還可用于治療小兒麻痹后遺癥、重癥肌無力、閉角形青光眼、腹膜炎和術后腸肌麻痹等癥，并且對腫瘤壞死因子的釋放有抑制作用[9-11]。

目前，加蘭他敏主要從石蒜科植物中提取，屬于石蒜科植物的次級代謝產物，但因長期過度采挖，致使石蒜類野生資源瀕臨枯竭，且直接從植物中提取加蘭他敏的得率極小。在如今人口老齡化程度日益嚴重的情況下，僅憑擴大石蒜科植物的種植面積、發展其快速繁殖技術等方法來獲取加蘭他敏已難以滿足市場需求[9]，故，開展對加蘭他敏的合成研究很有意義。本文就當前加蘭他敏的化學合成和生物合成研究現狀進行綜述，并對其今后發展做出展望。

1 加蘭他敏的化學合成途徑

自發現加蘭他敏以來，國內外已對加蘭他敏的化學合成開展了大量研究。1962年，Barton等[12]首次使用氧化偶聯方法全合成加蘭他敏；1969～1973年間，Kametani[13-15]研究小組一直致力于探索加蘭他敏的合成，并提出三條不同的氧化偶合路線成功合成加蘭他敏，但收率均不高，僅0.94～2.5%，或者直接通過去甲基加蘭他敏半合成加蘭他敏，盡管收率提高，但原料去甲基加蘭他敏在自然界存在量極少；1988年始，Jerzy小組[16-17]以酪胺和異香草醛作為原料，經過縮合、還原、甲?；?、溴化、氧化和還原等反應得到加蘭他敏，并于后續研究中首次提出以三仲丁基硼氫化鋰（L.Selectride）作為還原劑立體全合成加蘭他敏，但此途徑具成本高、副產物多且需利用層析柱分離的缺陷；Kita[18]在此基礎上更進一步對合成途徑做出了改善，改用二(三氟乙酸)碘苯（PIFA）為氧化劑合成加蘭他敏，并取得較好的結果。2001年，Guillou研究小組[19]提出利用分子內Heck反應全合成加蘭他敏。2004年，Strahil Berkova等[20]研究發現那維定(narwedine)是加蘭他敏合成的關鍵中間體，其對人的皮膚有嚴重刺激[4,21]。2006～2007年，劉濤等[22]進一步優化了加蘭他敏的合成條件，利用酪胺和異香草醛經過五步反應成功合成外消旋加蘭他敏；此外，該研究小組[23]還采用植物中提取加蘭他敏過程中的副產品力可拉敏為原料，利用鑭鎳稀土合金催化，使其半合成加蘭他敏，與全合成相比，此路線成本低、路線短，大大地推進了加蘭他敏的工業化進程。且利用中間體對加蘭他敏進行半合成制備，更有助于發展綠色產業。同時，張輔民[24]對加蘭他敏的合成進行了新探索，用3-羥基-4-甲氧基芐醇為原料，發展了一條新的仿生合成路線，避免了中間體那維定對皮膚等的嚴重刺激。日本的Ishikawa[25]和美國的Magnus等[26]也先后發現了兩條新途徑，前者利用1-(2-芐氧基-3-甲氧基苯基)丙酮，應用雙Michael-Clmsen串聯反應合成關鍵中間體，巧妙利用Michael加成及逆Michael加成，從而得到消旋加蘭他敏。后者先醚化取代酚，再3,3-遷移構建加蘭他敏的B環得中間體，最后進行簡單的亞胺縮合-還原反應構建D環，收率可達63%。近年，徐萍[27]提出了一種新思路，選用價格便宜的藜蘆醛為起始原料，以硝基為占位基團，若此方案成功，將大大縮減合成成本。

綜合分析發現，盡管國內外已有眾多關于加蘭他敏化學合成的報道，但其中大部分方法都存在不足：起始原料難以獲得、關鍵中間體那維定對人的皮膚有嚴重刺激、加蘭他敏產率低、合成成本高、步驟復雜等，致使目前加蘭他敏的化學合成僅適用于實驗室，無法投入工業生產。

2 加蘭他敏的生物合成途徑

2.1 加蘭他敏生物合成途徑的預測相關研究

目前，國內外關于加蘭他敏的生物合成途徑報道尚少，大多是以石蒜科植物為材料，對加蘭他敏生物合成途徑做出的推測。

1971年，Jeffs[28]提出了石蒜中加蘭他敏生物合成途徑的一種推測：因石蒜屬生物堿結構與松葉菊堿相似，根據非洲番杏Sceletium strictum中松葉菊堿的生物合成途徑，Jeffs推測加蘭他敏有平行的生物合成途徑，并得出其碳骨架可能由酪氨酸和苯丙氨酸構建。

1998年，Eichhorn[29]等以夏雪片蓮（Leucojum amaestivum）為材料，通過放射性同位素標記法，確認加蘭他敏直接由去甲基加蘭他敏生成，并推斷4'-O-甲基降孤挺花啶是石蒜屬生物堿（如加蘭他敏、文殊蘭胺、石蒜堿等）的通用前體，推測加蘭他敏的生物合成途徑可能有五個步驟，兒茶酚氧位甲基轉移酶(catechol-O-methyltransferase，COMT)先將降孤挺花啶(norbelladine)催化成4'-氧-甲基降孤挺花啶，再發生一系列反應得到加蘭他敏。其中COMT的表達與豐度可能對植物中加蘭他敏含量產生極大影響[30]。但因合成加蘭他敏的直接前體去甲孤挺花啶難以得到，而加蘭他敏屬于異喹啉類生物堿，按照生物合成途徑劃分，是屬于苯丙氨酸和酪氨酸系生物堿；Dewick等[31]補充推測降孤挺花啶是由來源于酪氨酸的酪胺和來源于苯丙氨酸的3,4-二羥基苯甲醛（原兒茶醛）合成；因此，3,4-二羥基苯甲醛和酪胺可看作是加蘭他敏合成的較近前體物質[32]。故，推測植物體內加蘭他敏生物合成途徑主要分為六個步驟，即：原兒茶醛+酪胺→降孤挺花啶4-氧-甲基降孤挺花啶→N-去甲那維定→N-去甲加蘭他敏→加蘭他敏?那維定，如圖1所示。

圖1 加蘭他敏可能生物合成途徑

2014年，MB Kilgore研究小組[33]對加蘭他敏生物合成途徑取得了重大突破，其成功組裝了黃水仙（Narcissus pseudonarcissus L.）轉錄組，并對轉錄組中氧-甲基轉移酶的基因序列進行了識別并表達，分離純化得到一個蛋白酶NpN4OMT，并證實其在加蘭他敏生物合成中過程中，具催化降孤挺花啶產生4'-氧-甲基降孤挺花啶的作用；其后，該研究小組通過比對黃水仙、雪花蓮、大雪片蓮等轉錄組，發現了對位C-C苯酚耦合細胞色素P450-CYP96T1[34]，具催化4'-氧-甲基降孤挺花啶產生N-去甲那維定的作用；2015年12月，Kutchan,Toni M.等[35]對其申請國家專利，公開試驗中石蒜科生物堿（含加蘭他敏）生物合成途徑中的關鍵酶鑒定及關于加蘭他敏等石蒜堿轉基因生物工程等有關發現，并且對涉及于加蘭他敏生物合成途徑中的降孤挺花啶4'-氧-甲基轉移酶、CYP96T1-3、以及降孤挺花啶合酶/還原酶進行編碼。石蒜科主要生物堿合成可能途徑如圖2所示。

對于加蘭他敏的生物合成，除上述途徑，目前還有另一條可能途徑：即利用莽草酸途徑產生苯丙氨酸，通過苯丙烷代謝等得到原兒茶醛等中間產物，最后得到加蘭他敏等生物堿，其中苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonialyas,PAL）是苯丙氨酸代謝途徑中的關鍵酶和限速酶[9,36]，但目前對于此途徑的研究尚少。

2.2 生物合成途徑相關酶的克隆及相關研究

2003年，謝峻等[37]對石蒜屬次生代謝產物加蘭他敏的生物合成提出了新思路，即通過基因改造，以構建轉基因植物的方法來解決加蘭他敏的來源。陳斌等[36]于2008年以忽地笑嫩葉為原料，采用RACE技術成功克隆了忽地笑中生物堿上游關鍵酶PAL基因核心片段和3'端片段，為忽地笑中PAL基因的全長基因克隆奠定了基礎。梁麗建等[30]采用同源克隆與RACE相結合的方法，首次從石蒜葉片中克隆到可能與加蘭他敏生物合成相關的COMT基因（COMT是一種S-腺苷-L-甲硫胺酸依賴的甲基轉移酶，目前在煙草、玉米、唐松草和粟等多種植物中被克隆[38]。），并命名為LrCOMT，為加蘭他敏基因調控技術提供研究基礎。因研究者發現，石蒜類植物不同部位加蘭他敏含量差異明顯[39-41]，推測其可能為不同部位基因存在差異，唐金鳳等[9,42]借助mRNA差異顯示技術（DD-PCR），對忽地笑中加蘭他敏含量最高的花蕊及含量最低的花葶進行差異基因篩選并成功克隆其差異片段，確認了2個與忽地笑加蘭他敏合成相關和1個可能與加蘭他敏運輸代謝調控有關的條帶；桂柳姿等[43]通過RACE技術成功克隆出忽地笑加蘭他敏合成途徑中的COMT酶基因（La-COMT），并通過與煙草、唐松草、玉米和罌粟的COMT基因進行同源性比對，確認該序列是COMT序列，與梁麗建等[30]克隆的石蒜COMT(LrCOMT)基因編碼相比，基因編碼的氨基酸數目一致，但氨基酸序列有所不同。2015年，伍美慧[1]對上述桂柳姿等[43]獲得的COMT基因片段成功構建pET-COMT重組質粒，并于大腸桿菌中高效表達出預期蛋白條帶，為進一步研究加蘭他敏生物合成代謝途徑中關鍵酶提供基礎。與此同時，別慶玲等[44]克隆得到一個新的忽地笑氧-甲基轉移酶(OMT)基因（LaOMT），其在忽地笑鱗莖、根、葉和花中均有表達，但與桂柳姿等[32]得到的忽地笑COMT基因（LaCOMT）在堿基數目和序列上均存在一定差異，目前，LaOMT基因是否與忽地笑加蘭他敏的合成相關尚有待證實。

3 其他生物技術生產加蘭他敏的研究

除上述利用基因工程方法合成加蘭他敏外，國內外亦有其他生物技術生產加蘭他敏的研究。2008年，彭菲實驗小組[45]發現忽地笑的不定根培養品中有加蘭他敏的存在，推測離體培養忽地笑的不定根，可能成為合成加蘭他敏的一條新途徑。趙志敏等[32,46]以忽地笑鱗莖為材料，通過內生菌分離發酵的方法，從中檢測出1株鑒定為半知菌綱青霉屬的真菌能夠產生加蘭他敏，推測忽地笑內生真菌有望成為生產加蘭他敏的新資源。此外，研究發現，在忽地笑培養過程中，添加酪胺等苯丙氨酸前體物對加蘭他敏的合成起促進作用，而水楊酸、絡氨酸等則不利于加蘭他敏的積累，另外，植物激素對加蘭他敏的積累也存在一定影響，有研究成果表明：高濃度的6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）促進加蘭他敏的合成，2，4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）和濃度高于0.5 mg/L的1-萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）抑制加蘭他敏的合成[47-49]，這些研究也為加蘭他敏合成代謝途徑可能是通過苯丙烷代謝途徑完成的提供佐證。

4 結論與展望

自發現加蘭他敏對AD等中樞疾病的優良藥用價值后，加蘭他敏的提取和合成一直備受關注。目前生產加蘭他敏的方法主要為化學合成法和植物提取法。前者的成本與從天然植物中直接提取相比相差無幾甚至略高，而后者也因為過程繁瑣，勞動強度大且產量極低，皆不利于大規模生產。為從根本上解決加蘭他敏供不應求的現狀，研究者需要另辟蹊徑，運用現代生物技術，探索加蘭他敏的生物合成途徑，通過基因工程等手段，以獲得加蘭他敏高表達的植株。因石蒜科植物是提取加蘭他敏的主要來源，探索石蒜科植物中加蘭他敏的生物合成途徑已成為研究熱點，前景非常廣闊。

目前，關于加蘭他敏的生物合成途徑仍不完善，需進一步對其進行研究驗證。其中關鍵酶COMT的成功克隆，無疑為加蘭他敏生物合成工業化生產帶來了新希望。但植物的次生代謝是在多種酶的共同作用下完成的，受多因素影響，加蘭他敏生物合成途徑中尚有許多相關酶未得到深入研究。

隨著加蘭他敏生物合成途徑研究的深入，研究者們需要選擇合適的材料和方法來進一步對加蘭他敏合成途徑中的前體進行驗證，找出途徑中其他相關酶并探究酶之間的協同性，從而構建加蘭他敏高表達的轉基因植物模型。與其他石蒜科植物相比，忽地笑具加蘭他敏含量相對較高、分布地域較廣、便于采集等優勢，后續研究中可選擇忽地笑（黃花石蒜Lycoris aurea(L'Her.)Herb.）為研究材料，通過RACE和PCR等克隆技術，得到加蘭他敏合成途徑中相關酶基因，并進一步深入探索其生物合成途徑及潛在酶，從基因水平上進行調控改造，達到其高表達目的，最終經過細胞培養、生物轉化、發根培養等得到目的轉基因植物。若設想實現，加蘭他敏的大規模工業生產將會成為現實，經濟效益也將十分可觀。

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（本文編輯 蘇 維）

Advances in the Synthesis Pathways of Galanthamine

ZHOU Ribao,LIU Changyu,PENG Meichen,WANG Zhaohui,LIU Xiangdan*
(School of Pharmacy,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China)

Galanthamine is a drug that is widely used in the treatment of Alzheimer's disease and etc.But according to the studies,the extraction yield of galanthamine in natural plants is very limited,researchers have studied on the synthesis of galanthamine.So far,a variety of chemical synthesis strategies were proposed.However,due to the defects of the current chemical synthesis,such as low yield,high cost,complicated steps and etc,the methods are not conducive to practical production,at present,the most effective alternative is to explore the biosynthetic methods for galanthamine.The review summarizes the research advances in the synthesis of galantamine,and emphatically introduces the biosynthesis and synthesisrelated enzymes of galantamine,the further study prospects of galantamine's synthesis are expected.

galanthamine;biosynthetic pathway;key enzyme;gene control;Lycoris radiata(L'Her.)Herb.

R914

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2016.12.021

2016-07-06

湖南省科技廳（2015SK2015）；國家中醫藥管理局“藥用植物學”重點學科資助（國中醫藥發[2009]30號）；湖南省科技廳（2015NK2153）；湖南省“中藥學”重點學科建設項目資助（湘教通[2011]76號）；湖湘中藥資源保護與利用協同創新中心（湘教通[2015]351號）。

周日寶，男，博士，教授，主要從事中藥資源質量與開發研究。

*劉湘丹，女，博士，副教授，E-mail:paeonia_dd@126.com。