栽培黃芩與其對照藥材的HPLC指紋圖譜及近紅外圖譜比較研究

趙建軍高曉娟++王英華++馬玲　王漢卿

[摘要] 黃芩為我國常用大宗中藥材，其野生資源急劇減少，目前我國寧夏、河北、山西、甘肅等地大面積栽培，供中藥材市場及臨床應用。該研究旨在通過12批栽培黃芩藥材和黃芩對照藥材的HPLC指紋圖譜及近紅外圖譜研究，對4個產區的栽培黃芩藥材進行質量評價。結果顯示，12批栽培黃芩藥材與黃芩對照藥材色譜指紋圖譜和近紅外圖譜的相似度分別大于0.961和0.983，結合12批栽培黃芩藥材與黃芩對照藥材共有峰面積（近紅外為對應點吸收值）的配對樣本t檢驗，均無顯著差異，驗證了12批栽培黃芩藥材與對照藥材質量的一致性較高。該研究基于色譜指紋圖譜與近紅外圖譜，并結合配對樣本t檢驗對分析結果進行驗證，避免了分析中因指紋圖譜相似度閾值限定不明確而引起的誤判，為分析結果提供了可靠的依據。同時，通過對綜合性較強的2種檢測手段的比較研究，為完善中藥材質量控制方法提供了新的思路。

[關鍵詞] 黃芩； 指紋圖譜； 近紅外； 化學成分； 質量控制

Comparative studies on HPLC fingerprint and nearinfrared spectra of

cultivated and reference crude Scutellaria baicalensis

ZHAO Jianjun1， GAO Xiaojuan1， WANG Yinghua1，3， MA Ling3， WANG Hanqing1，2*

（1. College of Pharmacy， Ningxia Medical University， Yinchuan 750004， China；

2. Ningxia Research Center of Modern Hui Medicine Engineering and Technology， Ningxia Medical University， Yinchuan 750004， China；

3. Ningxia Institute for Drug Control， Yinchuan 750004， China）

[Abstract] Scutellaria baicalensis is a common and important medicinal plant in China， facing with reducing sharply in wild resources. To meet the needs in Chinese herbwouls medicine market and clinical application， S. baicalensis has been widely cultivated in Ningxia， Hebei， Shanxi， and Gansu et al. HPLC fingerprint and nearinfrared were studied in the research to evaluate quality difference of S. baicalensis in four districts. The results showed that the similarity of HPLC fingerprint of 12 cultivated S. baicalensis and reference crude herb is more than 0.961， and the other is more than 0.983. On the other hand， paired sample ttest indicated there has no significant difference between the common peaks′ area of 12 cultivated S. baicalensis and reference crude herb. It was verified that 12 cultivated S. baicalensis has highly consistency with reference crude herb. On the basis of chromatographic fingerprint and nearinfrared spectrum， the study applied paired sample ttest to verify analysis results， which could avoid erroneous judgment induced by indefinite threshold values in the similarity of chromatographic fingerprint and provide reliable basis for the analysis results. Meanwhile， it also provides a new idea for improving the quality control method of Chinese medicinal materials by comparative study about two comprehensive detection means.

[Key words] Scutellaria baicalensis； fingerprint； nearinfrared spectra； chemical composition； quality control

doi：10.4268/cjcmm20162220

黃芩Scutellaria baicalensis Georgi為唇形科黃芩屬多年生草本植物[1]，其根黃芩Scutellariae Radix 為大宗中藥材，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎之功[2]。研究表明黃芩中黃芩素、黃芩苷等黃酮類成分是其主要藥效成分[3]，具有抗炎、抗菌、抗氧化、鎮痛、保肝等多種藥理作用[45]。隨著藥理研究的深入，其藥效價值不斷得到開發，野生資源因此急劇減少，黃芩已列入Ⅲ級國家重點保護野生藥材物種。為滿足市場需求，自1958年以來，寧夏、河北、山西、甘肅等地開始大面積栽培[6]。影響中藥材質量因素是復雜而多變的，如產地、采收期、規格、生長方式等。因此，為了全面的控制及評價中藥材質量，引入指紋圖譜的中藥質量評價模式已成為國內外共識[7]。

色譜圖譜具有重復性高、分離性能好、分析速度快、使用范圍廣等優點已被廣泛用于中藥指紋圖譜的研究[89]。但其局限性也較為明顯，任何與色譜相關實驗條件的改變，都意味著整體色譜圖形的變異，給中藥材評價工作造成一定困難，與此同時指紋圖譜的解析也是研究的一大難點，常用的相似度比較的方法雖然方便，但人為主觀判斷成分較多，缺乏相似度閾值的限定，缺乏評判的客觀標準[10]。近紅外光譜分析是一種快速、價廉、無損分析方法，適用于固體、液體等形態，可用于藥物研發、生產等生產過程的質量監控。其與化學計量學結合，已被用于農業、食品、化學和石油化工等領域的定性和定量分析[11]。介于近紅外光譜分析的優勢，其方法對中藥材質量的評價結果是否與指紋圖譜方法的一致，相關研究還少有報道。

本研究采用HPLC測定12批不同產地栽培黃芩藥材和1批黃芩對照藥材中黃芩苷的含量并建立色譜指紋圖譜。同時，基于近紅外光譜分析技術建立黃芩藥材的光譜指紋圖譜，并對指紋圖譜及近紅外光譜進行比較分析，判斷2種分析方法中，12批栽培黃芩與對照藥材相比較的質量差異。

1 材料

高效液相色譜儀（Agilent 1260 LC色譜工作站，G1313A自動進樣器，G1316A柱溫箱，G1311A四元泵，G1379A脫氣機，G1314A紫外檢測器）；AE240電子分析天平（1/1萬）；超聲清洗機；Bruker MatrixF型傅利葉變換近紅外光譜儀（測試條件：分辨率8 cm-1；樣品累積掃描次數32 Scans；背景累積掃描次數32 Scans；光譜范圍12 000～4 000 cm-1；軟件為OPUS 5.5）。

黃芩苷對照品（批號110715200212，中國食品藥品檢定研究院）；甲醇、乙腈為色譜純；娃哈哈純凈水；其他試劑均為分析純。

實驗所用的12批栽培黃芩藥材采自于4個產區，經王英華主任藥師鑒定為唇形科黃芩屬植物黃芩S. baicalensis，樣本信息見表1。黃芩對照藥材來自于中國食品藥品檢定研究院。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱Phenomenex Gemini C18柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm）；流動相甲醇乙腈醋酸、醋酸鈉（pH 4.5）緩沖液，梯度洗脫程序見表2；流速1.0 mL·min-1；柱溫25 ℃；檢測波長276 nm；進樣量10 μL。

2.2 色譜對照品溶液制備

精密稱量黃芩苷對照品 0.016 06 g，置于10 mL的量瓶中，加適量色譜甲醇使溶解，定容至刻度，得黃芩苷對照品儲備液。精密量取黃芩苷對照品儲備液4 mL，置于25 mL量瓶中，加甲醇定容，配制成質量濃度為0.257 g·L-1的黃芩苷對照品溶液，備用。

2.3 色譜供試品溶液制備

黃芩藥材粉碎，過80目篩，精密稱取0.5 g，置100 mL量瓶中，加入70%甲醇100 mL，稱重，室溫超聲提取45 min，靜置，補足失重，取上清液過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.4 色譜方法學考察

2.4.1 精密度試驗 取13號對照藥材供試品溶液，連續進樣5次，以黃芩苷為標準峰，各主要色譜峰相對峰面積和相對保留時間的RSD均小于5.0%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復性試驗 取13號對照藥材粉末5份，每份0.5 g，按2.3項制備供試品溶液，按2.1項色譜條件進樣檢測。5次測得的各主要色譜峰峰面積和保留時間的RSD均小于5.0%，表明該方法重復性良好。

2.4.3 穩定性試驗 取13號對照藥材供試品溶液，分別于放置0， 2， 4， 8， 12， 24 h，按2.1項色譜條件進樣檢測。測得各時間段的RSD均小于5.0%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.5 樣品色譜測定

分別精密對照品和供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣檢測，記錄90 min色譜圖，見圖1。

2.6 樣品近紅外光譜測定

分別取烘干至恒重且過80目篩的黃芩藥材粉末適量，在Bruker MatrixF型傅利葉變換近紅外光譜儀掃描近紅外光譜，測試條件：分辨率8 cm-1；樣品累積掃描次數32 Scans；背景累積掃描次數32 Scans；光譜范圍12 000～4 000 cm-1；軟件為OPUS 5.5。每個樣品平行測定6次，取平均值作為該樣品的原始光譜，環境條件為溫度23 ℃，濕度40%。

2.7 數據分析

2.7.1 指紋圖譜相似度分析 采用中國藥典委員會頒布的中藥色譜指紋圖譜相似度評價（A版），以對照藥材色譜峰為參照峰，對12批黃芩藥材和對照藥材指紋圖譜進行自動匹配，并對所有的HPLC指紋圖譜全譜進行相似度計算，用相關系數表征相似度。

2.7.2 近紅外特征譜段相關系數分析 采用OPUS軟件對獲取的各批次黃芩藥材及對照藥材的近紅外光譜進行一階導數+矢量歸一化預處理，以對照藥材近紅外光譜為參考光譜，計算各批次黃芩藥材測定光譜與參考光譜的相關系數，比較其與參考光譜的相似程度。

2.7.3 共有峰差異顯著性分析 采用SPSS 19.0 中的配對樣本t檢驗分別分析各栽培黃芩藥材與黃芩對照藥材的色譜指紋圖譜和光譜指紋圖譜共有峰吸收是否存在顯著差異。

3 結果

3.1 黃芩苷含量測定

采用HPLC測定12批栽培黃芩藥材和黃芩對照藥材中黃芩苷含量數據，見表1。由表1可知，對照藥材中黃芩苷含量高于其他各批次藥材，但是，各批次藥材中黃芩苷含量均高于2015年版藥典規定的含量（9.0%），說明各產地栽培黃芩均可作為合格黃芩藥材使用。

3.2 栽培黃芩色譜指紋圖譜及相似度評價

12批黃芩藥材和黃芩對照藥材按2.1項制備供試品溶液后按2.3項色譜條件進行檢測，記錄90 min色譜圖，建立了黃芩HPLC指紋圖譜。色譜記錄數據經Aligent工作站導出AIA.格式數據后輸入中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件中進行共有峰標定和相似度計算。以匹配數目為13的色譜峰為共有峰，共標定23個共有峰，見圖2，各共有峰的保留時間和峰面積見表3。由表3可知，各共有峰保留時間的RSD均小于0.40%，說明該方法準確、可靠，可以用于黃芩藥材的質量評價。以13號黃芩對照藥材為參照譜圖計算的相似度，1～12號樣品與對照藥材的相似度分別為0.980，0.961，0.984，0.989，0.987，0.983，0.989，0.995，0.995，0.974，0.990，0.983。由相似度計算結果可知，用于建立指 紋圖譜的12批栽培黃芩藥材和黃芩對照藥材相似度較高（0.961～0.995），說明各產地栽培黃芩與對照藥材的一致度較高。

3.3 栽培黃芩共有峰面積與黃芩對照藥材共有峰面積差異分析

依據表3中各樣品共有峰面積值，12批栽培黃芩的共有峰面積值分別與黃芩對照藥材共有峰面積進行配對樣本t檢驗，檢驗結果見表4。由表4可知，各批次栽培黃芩藥材的共有峰面積與對照藥材共有峰面積無顯著差異。

3.4 栽培黃芩近紅外光譜分析

獲取的12批栽培黃芩藥材及黃芩對照藥材的近紅外原始光譜見圖3。近紅外光譜常受到光程、樣品厚度、基線漂移等因素的影響，在分析之前需要對其進行預處理。矢量歸一化可以消除光程或樣品厚度的影響，而導數化可以消除基線漂移等因素的影響，本研究采用一階導數+矢量歸一化對各批栽培黃芩藥材近紅外圖譜進行預處理，預處理后圖譜見圖4。對預處理后的近紅外圖譜利用OPUS 5.5軟件，以對照藥材圖譜為參照譜圖，計算1～12號栽培黃芩近紅外圖譜與黃芩對照藥材圖譜的相似度結果分別為0.991， 0.989， 0.983， 0.993， 0.993， 0.991， 0.990， 0.995， 0.994， 0.995， 0.992，

0.990。由相似度計算可知，各批次栽培黃芩藥材與黃芩對照藥材的近紅外光譜相似度較高（0.983～0.995），說明各產地栽培黃芩與對照藥材在近紅外光譜分析層面上的一致度較高。

3.5 栽培黃芩藥材與黃芩對照藥材近紅外吸收差異

利用OPUS軟件對各批近紅外光譜進行一階導數和矢量歸一化預處理后導出各點吸收數據，分別將12批栽培黃芩藥材的近紅外吸收數據與黃芩藥材的吸收數據進行配對樣本t檢驗，檢驗結果見表5。由表5可知，各批次栽培黃芩藥材的近紅外吸收與對照藥材近紅外吸收無顯著差異。

4 討論

常用中藥指紋圖譜研究的方法與技術包含廣泛，如薄層色譜法、液相色譜法、氣相色譜法、近紅外光譜法、X射線衍射法及核磁共振法等。其中液相色譜法是最常用的指紋圖譜研究方法。但其不足之處也較為明顯[12]，如對中藥這樣一個復雜體系，同時解決分離與檢測兩大問題，單一的分離與檢測模式容易丟失大量信息；其次由于實驗條件的微小改動就會顯著的影響實驗結果，對重現性有較大挑戰，這也是眾多研究黃芩指紋圖譜的文章當中，色譜圖有較大差異的原因之一。近年來，近紅外光譜技術較多的應用于中藥的鑒別和定性、定量的分析中。其方法快速、方便、準確、非侵入式分析、易于實現生產過程的在線控制等優點[13]。但也有其方法的局限性，如：近紅外光譜較差的特征性，導致分析技術對化學計量學極其依賴；作為相對分析技術，數學模型的建立需要傳統分析方法輔助等[14]。

本研究分別采用HPLC指紋圖譜和近紅外光譜對4個產區12批栽培黃芩藥材與其對照藥材的差異進行研究，結果表明：色譜指紋圖譜與近紅外光譜相似度表征中，12批栽培黃芩藥材與其對照藥材的相似度均較高（均大于0.96）。雖然相似度均較高，但由于相似度沒有客觀的閾值限定，為確保所得結論的可靠性，同時采用12批栽培黃芩藥材指紋圖譜共有峰面積（近紅外為各點吸收值）與黃芩對照藥材的共有峰面積（近紅外為各點吸收值）進行配對樣本t檢驗比較其差異，結果表明12批黃芩栽培藥材均與黃芩對照藥材的吸收無顯著差異，與相似度結果一致。色譜指紋圖譜、近紅外光譜及配對樣本t檢驗的綜合方法相互驗證，為最終所得結果12批栽培黃芩藥材與黃芩對照藥材品質無顯著差異，作為合格藥材使用提供了可靠的分析依據。

本研究首次同時用色譜指紋圖譜和近紅外光譜分析栽培黃芩與其對照藥材的質量差異，并結合配對樣本t檢驗對分析結果進行驗證。一方面避免了分析中因指紋圖譜相似度無閾值而引起的誤判；另一方面通過多種分析的相互驗證，為分析結果提供了可靠的依據，同時，為完善中藥材質量控制方法提供了新的思路。

上述實驗結果提出了新的思考方向，HPLC指紋圖譜與近紅外光譜的一致性問題是否在某些中藥材原料中，近紅外光譜可以對HPLC指紋圖譜進行補充或替代，從而在鑒定中藥材原料符合我國藥典質量標準的基礎上，采用更加經濟與環境友好的實驗方法，還需要進一步研究。

[參考文獻]

[1] 中國植物志編輯委員會.中國植物志[M].北京：科學出版社，1977.

[2] 中國藥典.一部[S].2015：301.

[3] 王丹，蔣亞杰，梁艷，等.黃芩不同規格與化學成分及內在質量相關性的研究[J].中國中藥雜志， 2012， 37（4）：426.

[4] 施高翔，邵菁，汪天明，等.黃芩及其有效成分抗菌作用新進展[J].中國中藥雜志， 2014， 39（19）：3713.

[5] 柴玉爽，雷帆，邢東明，等.黃芩苷對模式識別受體TLR2/4NOD2的作用及其成藥性意義[J].中國中藥雜志， 2013， 38（16）：2639.

[6] Yuan Q J， Zhang Z Y， Hu J， et al. Impacts of recent cultivation on genetic diversity pattern of a medicinal plant， Scutellaria baicalensis[J]. Bmc Genetics， 2009， 11（1）：52.

[7] 梁逸曾，易倫朝，黃熙， 等.中藥分析新思路及其質量控制[J].分析測試學報， 2014， 33（2）：119.

[8] 黃洋，邵慧凱，路麗，等.不同采收期小葉榕葉HPLC指紋圖譜研究[J].中草藥，2014， 45（2）：271.

[9] 邵林，郭慶梅，冉蓉，等.山東不同栽培品種金銀花HPLC指紋圖譜的比較[J].中國實驗方劑學雜志，2011（19）：117.

[10] 詹雪艷，史新元，段天璇，等.色譜指紋圖譜相似度方法的研究進展[J].中國實驗方劑學雜志， 2011， 17（2）：248.

[11] Roggo Y， Chalus P， Maurer L， et al. A review of near infrared spectroscopy and chemometrics in pharmaceutical technologies [J]. J Pharm Biomed Anal， 2007， 44（3）：683.

[12] 陳林偉，秦昆明，徐雪松，等.中藥指紋圖譜數據庫的研究現狀及展望[J].中草藥， 2014， 45（21）：3041.

[13] 袁明洋，黃必勝，余馳，等.8種含碳酸鹽的礦物類中藥近紅外定性定量模型的建立[J].中國中藥雜志， 2014， 39（2）：267.

[14] 汪小莉，李嬛，秦昆明，等.近紅外光譜學與化學計量學在中成藥液體制劑過程分析中的應用[J].中草藥， 2013， 44（15）：3420.

[責任編輯 丁廣治]