補骨脂乙醇提取物小鼠灌胃急性及亞急性毒性試驗研究

阿卜杜米吉提·阿卜力孜+阿布都吉力力·阿布都艾尼+艾西木江·熱甫卡提+尤力都孜·買買提+李治建+斯拉甫·艾白

[摘要] 目的 研究補骨脂乙醇提取物（EEPF）的急性毒性特點。 方法 急性毒性分對照組和EEPF組[12.0 g/（kg·d）]，灌胃給藥，亞急性毒性分對照組和EEPF 0.65、1.30 g/kg組，灌胃給藥14 d，進行一般觀察，檢測體重、臟器重量及系數、血液學及血液生化學，并進行肝臟、腎臟組織病理學檢查。 結果 急性毒性小鼠死亡14只，可見肝臟中央靜脈擴張充血，部分腎小管擴張；亞急性毒性給藥14 d未見明顯反應，EEPF低劑量組雄性脾臟重量及系數明顯降低、雌性胸腺重量及系數明顯升高（P < 0.05），雌性高劑量組體重明顯升高（P < 0.05）、腎臟系數顯著降低（P < 0.01）；血液學：EEPF組雄性中性粒細胞計數（NEUT）比例（%）、單核細胞（MONO）比例（%）明顯降低（P < 0.05），紅細胞（RBC）、血紅蛋白（HGB）、血細胞比容（HCT）（%）、淋巴細胞（LYMPH）（%）明顯升高（P < 0.05），雌性RBC明顯升高（P < 0.05），血小板計數（PLT）和血小板壓積（PCT）顯著升高（P < 0.01）；血液生化學：EEPF雄性低劑量組A/G顯著升高（P < 0.01），尿素氮（BUN）明顯升高（P < 0.05），高劑量組丙氨酸氨基轉移酶（ALT）和三酰甘油（TG）顯著降低（P < 0.01），雌性低、高劑量組總膽紅素（TBIL）明顯降低（P < 0.05），TG顯著降低（P < 0.01），總膽汁酸（TBA）和ALT明顯升高（P < 0.05），高劑量球蛋白（GLOB）明顯降低（P < 0.05）；EEPF組出現肝細胞壞死、腎小球萎縮。 結論 EEPF最大給藥量12.0 g/kg可致部分小鼠70%死亡；亞急性毒性EEPF 0.65、1.30 g/kg對小鼠血液學、血液生化學有一定影響，肝臟、腎臟可見毒性病變。

[關鍵詞] 補骨脂乙醇提取物；小鼠；急性；亞急性；毒性

[中圖分類號] R285.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2016）11（a）-0020-05

補骨脂為豆科植物補骨脂Psoralea corylifolia L.的干燥成熟果實，是中醫、維吾爾醫常用藥材[1]，具有溫腎助陽、納氣平喘、溫脾止瀉等作用，用于腎陽不足、陽痿遺精等，外用治白癜風、斑禿[2-3]?！缎l生部藥品標準——維吾爾藥分冊》收載的含補骨脂的白癜風治療制劑有9種[4]；《中國藥典》（2015年版）中收載的含補骨脂的中成藥就有40種[2]，臨床應用更廣泛。有報道補骨脂及其復方具有肝毒性[5-11]，其安全性值得關注。如不能闡明其毒性的特點，將會限制補骨脂的推廣使用。本研究對補骨脂乙醇提取物（ethanol extract of Psoraleae Fructus，EEPF）小鼠灌胃急性及亞急性毒性進行研究，探討其毒性作用及靶器官，為其重復給藥毒性研究提供相關的信息，以及臨床應用急性中毒解毒提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

1.1.1 藥品

EEPF，批號：20160310，按高效液相色譜法測定[2]，含補骨脂素5.22 mg/g、異補骨脂素3.78 mg/g和補骨脂酚231.15 mg/g。藥材購自新疆齊康哈博維藥有限責任公司（批號：20151027），由新疆維吾爾醫藥研究所希爾艾力主任藥師鑒定為正品。提取方法：取藥材10 kg，10倍量75%乙醇加熱回流提取1 h，共3次，合并提取液濃縮干燥，出膏率為9.51%。

1.1.2 試劑

丙氨酸氨基轉移酶（ALT）（批號：140215003）；天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）（批號：140115002）；堿性磷酸酶（ALP）（批號：140314022）；尿素氮（BUN）（批號：141315001）；肌酐（Cr）（批號：141315016）；總蛋白（TP）（批號：140815002）；白蛋白（ALB）（批號：140915013）；總膽固醇（TC）（批號：141615013）；血糖（GLU）（批號：141515012）；總膽紅素（TBIL）（批號：140615012）；磷酸肌酸激酶（CK）（批號：142515012）；三酰甘油（TG）（批號：141715014）；谷氨酰轉肽酶（GGT）（批號：141715032），均由深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司提供。血液學試劑，SYSMEX公司，批號：A2007。

1.2 動物

昆明小鼠，體重（20±2）g，購自新疆實驗動物研究中心，SPF級，許可證號：SCXK（新）2011-0001。飼養于新疆維吾爾醫藥研究所SPF級動物房，自由飲水、攝食，室溫20～26℃，濕度40%～70%，光照/黑暗12/12 h。

1.3 方法

1.3.1 EEPF急性毒性試驗

1.3.1.1 分組及劑量 設對照組（0.5%CMC-Na）、EEPF [12.0 g/（kg·d）]組，每組20只，雌、雄各半。按補骨脂藥材每天臨床用量10 g[2]、出膏率為9.51%計算，相當于日服用提取物0.951 g，EEPF 12.0 g/（kg·d）相當于臨床人（60 kg計算）每公斤體重用藥量的約750倍。

1.3.1.2 給藥方法 以EEPF最大配制濃度20%，每次灌胃給藥0.3 mL/10 g（每次6.0 g/kg），2次/d，間隔4～5 h給藥第2次，合計12.0 g/（kg·d）。進行常規指標觀察。

1.3.2 EEPF亞急性毒性試驗

1.3.2.1 分組及劑量 小鼠隨機分組，每組20只，雌、雄各半，設對照組（Ⅰ組），EEPF 0.65 g/kg（Ⅱ組）、1.30 g/kg組（Ⅲ組），分別為臨床劑量的40、80倍。

1.3.2.2 給藥方法 以EEPF配制濃度3.4%（低劑量）、6.8%（高劑量），灌胃給藥0.2 mL/10 g，1次/d，共14 d。

1.4 觀察指標

給藥前（D0）和給藥第1、4、7、11、14天稱取體重；末次給藥后禁食過夜毛細管眼眶采血加入抗凝劑檢測紅細胞（RBC）、白細胞計數（WBC）、血小板（PLT）、血紅蛋白（HGB）、血細胞比容（HCT）、平均紅細胞體積（MCV）、平均血紅蛋白量（MCH）、平均血紅蛋白濃度（MCHC）、網織紅細胞（Ret）。另外眼眶采血1.5 mL不加抗凝劑測定血液生化學指標。取肝臟、腎臟、胸腺、脾臟稱重計算臟器系數（臟器重量/體重×100%），肝臟、腎臟于15%甲醛溶液固定，HE染色，觀察組織形態變化。

1.5 統計學方法

采用PEMS統計軟件進行統計，組間比較時采用單因素方差分析，方差齊時用t檢驗，方差不齊時用秩和檢驗。結果以均數±標準差（x±s）表示，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EEPF急性毒性試驗

第1次給藥后小鼠出現活動減少、呼吸急促、倦怠、豎毛等癥狀，無死亡；第2次給藥后1 h內死亡14只，其中雄性5只、雌性9只，解剖可見肝臟充血，剩余動物24 h后恢復正常，觀察14 d未見明顯癥狀。由圖1～2可見，組織病理學檢查EEPF組肝臟中央靜脈擴張充血，部分腎小管擴張。

2.2 EEPF亞急性毒性試驗

2.2.1 一般觀察

與Ⅰ組比較，亞急性毒性試驗EEPF組給藥14 d未見明顯反應，動物無死亡。

2.2.2 體重、臟器重量級系數

與Ⅰ組比較，Ⅲ組雌性給藥第4～14天體重升高，雄性未見明顯改變（圖3～4）；雄性低劑量組脾臟重量及系數明顯降低（P < 0.05），雌性低劑量組胸腺重量及系數明顯升高（P < 0.05），雌性高劑量組腎臟系數顯著降低（P < 0.01）。

（n = 10）

2.2.3 血液學

與Ⅰ組比較，EEPF組雄性RBC、HGB、HCT、LYMPH明顯升高（P < 0.05），MONO明顯降低（P < 0.05），Ⅱ組NEUT明顯降低（P < 0.05），WBC顯著升高（P < 0.01）；雌性動物Ⅲ組PLT、PCT顯著升高（P < 0.01），RBC明顯升高（P < 0.05），其余指標與Ⅰ組比較未見明顯改變，見表2～3。

2.2.4 血液生化學

與Ⅰ組比較，雄性動物Ⅲ組ALT、TG顯著降低（P < 0.01），Ⅱ組A/G顯著升高（P < 0.01），BUN明顯升高（P < 0.05）；雌性動物EEPF組TBIL明顯降低（P < 0.05），TG顯著降低（P < 0.01），Ⅲ組GLOB明顯降低（P < 0.05），Ⅱ組ALT、TBA明顯升高（P < 0.05），其余指標與Ⅰ組比較未見明顯改變，見表4～5。

2.2.5 組織病理學檢查

Ⅰ組肝腎組織未見明顯改變。EEPF組可肝細胞壞死、腎小球萎縮。見圖5～6。

3 討論

急性毒性EEPF可致70%動物死亡，且雌性死亡多于雄性，死亡動物肝臟中央靜脈擴張充血，部分腎小管擴張。亞急性毒性試驗雌性高劑量組體重明顯升高，雄性體重未見明顯改變，EEPF組脾臟、胸腺重量及系數與對照組比較雖有統計學差異，但均為低劑量改變，無明顯劑量效應關系，考慮非藥物引起。血液生化學雄性ALT的降低、雌性TBIL的降低雖有統計學差異，無毒理學意義，雌雄小鼠TG均明顯降低，雌性GLOB有一定降低，判斷與影響肝臟脂質代謝相關，組織病理學檢查可見EEPF組肝細胞壞死、腎小球萎縮，且雌性腎臟系數有一定降低，雌性ALT、TBA升高，臨床報道其肝損傷特點多為女性ALT、TBA升高，與臨床表現具有相似性[6，11]，判斷TG、GLOB的降低和LYMPH的升高與影響肝臟功能相關，考慮EEPF對雌性肝、腎有一定影響。

另外，EEPF可引起小鼠RBC、HGB、HCT、PCT升高，對小鼠血液學有一定影響。有文獻報道補骨脂素具有提高小鼠造血功能的作用[12-13]?！吨袊幍洹分泻a骨脂的此類復方有“補腎養血丸”“再造生血片”等均作用于造血系統[14]。因此，判斷EEPF對小鼠血液學的影響可能與其功能主治相關。

補骨脂要含香豆素、黃酮等化合物[15-18]。臨床應用[5-6]和毒理學研究[7-9]發現補骨脂及復方對肝臟有一定的毒性作用[19-21]。韓國曾報道了與食用補骨脂有關的急性肝炎病例[5]，部分含有補骨脂的中成藥亦偶見肝毒性報道[10]。2009年香港報道3例肝損害病例，患者均使用補骨脂方劑[11]。本研究可見EEPF可致肝細胞壞死、腎小球萎縮，其毒性特點、毒性成分及機制有待進一步研究。

[參考文獻]

[1] 阿不都熱依木·卡地爾.中華本草維吾爾藥卷[M].上海：上?？茖W技術出版社，2005：191-192.

[2] 國家藥典委員會.中國藥典[S].一部.北京：中國醫藥科技出版社，2015：187-188.

[3] 張丹丹.胸腺肽聯合復方補骨脂酊治療白癜風的臨床療效觀察[J].中國社區醫師，2016，32（1）：117-119.

[4] 中華人民共和國衛生部藥典委員會.中華人民共和國衛生部藥品標準——維吾爾藥分冊[S].烏魯木齊：新疆科技衛生出版社，1999：116-205.

[5] 張抗懷，王娜，蔡艷.驅白巴布期片致嚴重肝損傷[J].藥物不良反應雜志，2013，15（4）：235.

[6] Nam SW，Baek JT，Lee DS，et al. A case of acute cholestatic hepatitis associated with the seeds of Psoralea corylifolia（Boh-Gol-Zhee）[J]. Clin Toxicol，2005，43（6）：589-591.

[7] 周昆，代志，柳占彪，等.補骨脂水提物引起的大鼠肝損害[J].天津中醫藥大學學報，2013，32（4）：221-224.

[8] 江芳，周昕睿，王旗，等.補骨脂酚及其與補骨脂素合用對HK-2細胞的毒性及其機制[J].中國藥理學與毒理學雜志，2010，24（1）：50-58.

[9] Wang J，Jiang Z，Ji J，et al. Evaluation of hepatotoxicity and cholestasis in rats treated with EtOH extract of Fructus Psoraleae [J]. J Ethnopharmacol，2012，144（1）：73-81.

[10] 周昆，代志，柳占彪，等.壯骨關節丸中肝毒性藥材的篩選研究[J].中國藥物警戒，2009，6（11）：641-648.

[11] Cheung WI，Tse ML，Ngan T，et al. Liver injury associated with the use of Fructus Psoraleae（Bol-gol-zhee or Bu-gu-zhi）and its related proprietary medicine [J]. Clin Toxicol，2009，47（7）：683-685.

[12] CFDA.藥物單次給藥毒性研究技術指導原則[S].2014-5-13. http：//www.cde.org.cn/zdyz.do？method=largePage&id=189

[13] 孫玉雯，程艷玲，鄒陽，等.大黃素補骨脂素對輻射損傷小鼠造血功能的影響[J].時珍國醫國藥，2014，25（10）：2342-2344.

[14] 周建國，馬雙姣，黃玉龍，等.種子類藥材補骨脂及其混偽品的ITS2條形碼序列鑒定[J].世界中醫藥，2016，11（5）：786-790.

[15] 劉國良，于英君，姚遠，等.補骨脂二氫黃酮甲醚對A375細胞黑素合成及ER/MAPK信號通路的影響[J].中國醫藥導報，2015，12（36）：4-8，20.

[16] 楊彤彤，李靜，秦民堅，等.補骨脂中兩個新的黃酮類化合物[J].藥學學報，2009，44（12）：1387-1390.

[17] 楊再波，鐘才寧，鄧維先，等.頂空氣相色譜-質譜法分析補骨脂揮發油化學成分[J].分析實驗室，2008，27（4）：87-90.

[18] 陳業高，于麗麗.補骨脂化學成分的研究[J].云南師范大學學報，2005，25（4）：52-54.

[19] 顏冬梅，高秀梅.補骨脂化學成分研究進展[J].遼寧中醫藥大學學報，2012，14（9）：96-99.

[20] 張秋玲，楊佳，盧奕霞.白蝕丸致肝損害[J].藥物不良反應雜志，2010，12（4）：297-298.

[21] 李艷豐，程國印.臨床藥師參與中藥補骨脂致肝損害的藥學監護[J].中國醫院用藥評價與分析，2016，16（4）：571-573.

（收稿日期：2016-07-11 本文編輯：張瑜杰）