雷公藤內酯醇對足細胞EMT相關蛋白mRNA表達的影響

朱伶俐　葉迅

[摘要] 目的 通過觀察雷公藤內酯醇（TP）對高糖刺激下ILK、MMP9、NEPH1蛋白表達的影響，探討TP抑制足細胞上皮-間充質轉分化（EMT）治療糖尿病腎病的可能機制。 方法 將培養分化成熟的足細胞分為對照組（D-葡萄糖5 mmol/L）、高糖組（D-葡萄糖25 mmol/L）、低TP組（25 mmol/L D-葡萄糖+8 ng/mL TP）、中TP組（25 mmol/L D-葡萄糖+16 ng/mL TP）以及高TP組（25 mmol/L D-葡萄糖+ 32 ng/mL TP）。體外培養48 h后，倒置顯微鏡觀察細胞形態，并采用PCR半定量分析技術檢測ILK、MMP9、NEPH1的表達。 結果 高糖刺激下足細胞NEPH1的表達較對照組顯著減少（P<0.01），而ILK、MMP9的mRNA表達較對照組顯著升高（P<0.01）。各劑量TP組足細胞NEPH1 mRNA的表達均較高糖組明顯上調（P<0.01），ILK、MMP9 mRNA的表達較高糖組明顯下降（P<0.01），其中以中TP組的干預作用最顯著（P<0.01）。 結論 TP可能通過抑制ILK信號通路來抑制足細胞EMT。

[關鍵詞] 雷公藤內酯醇；足細胞；高糖；上皮-間充質轉分化

[中圖分類號] R197 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2016）31-0001-04

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是一類以進行性腎臟纖維化為特征的疾病，是糖尿病最主要的微血管并發癥之一。其最主要的臨床表現為蛋白尿，而腎小球纖維化是產生蛋白尿的組織學基礎。足細胞通過已分化上皮細胞向間充質細胞轉分化（Mesenchymal transdifferentiation，EMT），是影響腎小球濾過屏障功能和結構，使腎小球纖維化的重要因素[1]。其特點為失去上皮細胞特征如足細胞裂孔膜蛋白（nephrin）和NEPH1～3等，導致成纖維細胞特殊蛋白l（fibroblast-specific protein 1，FSP-1）、整合素連接激酶（ILK）、細胞外基質纖維連接蛋白（fibronectin，FN）和基質金屬蛋白酶9（MMP-9）等間充質細胞樣表型標志物表達上調[2]。已發現的介導足細胞EMT的主要信號通路有TGF-β/smad、integrin/ILK和Wnt/β-acatenin三條。三條通路既有各自的信號傳導路徑，又在不同層面相互連接、整合，組成錯綜復雜的網絡，共同調控足細胞的EMT過程。其中，ILK信號通路在足細胞EMT的過程中起重要的調節作用[3]。

雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook.F.，TwHF）是藤本植物雷公藤的干燥塊根，中藥學認為其味苦、辛，性寒，有大毒，歸肝、腎經。功能祛風除濕 、通絡止痛，兼殺蟲解毒。臨床主要用于治療類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡、腎臟疾病等炎性和自身免疫性疾病。其用于治療腎病已有30余年歷史 ，從最初的生藥煎劑到雷公藤提取物，取得了令人矚目的療效[4]。雷公藤內酯醇（triptolide，TP）是從其中分離所得的一種二萜類化合物，可通過靶向轉錄因子、激酶或抑制泛素/蛋白酶體等機制發揮抑制細胞增殖和促腫瘤細胞凋亡等抗腫瘤作用[5]。大量體內外研究均證實，雷公藤內酯醇具有保護足細胞、抑制蛋白尿的作用[6，7]。本研究觀察TP通過對ILK信號通路的調節作用，干預高糖誘導小鼠足細胞EMT，探討TP對高糖環境下受損足細胞的可能保護機制。

1 材料與方法

1.1 一般材料

1.1.1 細胞 本研究采用的小鼠腎小球足細胞為英國倫敦大學國王學院Guy's 醫院贈送。

1.1.2 藥物 葡萄糖（中國大冢制藥有限公司），雷公藤內酯醇（杭州達文生物技術有限公司）。

1.2 儀器與試劑

超凈工作臺，空氣過濾器（北京市昌平長城空氣凈化設備公司），恒溫 CO2培養箱（B5060EK/CO2德國產），450 型自動酶標儀（MuLtiskan Ascent V1. 24345-00627T），伯樂PCR 儀，凝膠成像系統（ BIO-RAD），RPMI 1640培養液、胎牛血清（美國GIBCO公司），γ-干擾素（美國PEPROTECH公司），Trizol提取試劑盒（美國Invitrogen公司），RT-PCR試劑盒（日本TaKaRa公司），引物合成（PRIMER5.0引物軟件設計，上海生物工程公司合成），SDS-PAGE凝膠試劑盒（北京普利萊基因技術有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養 復蘇后的小鼠足細胞加入含有5 mL 10% FCS1640培養液的50 mL培養瓶中，每瓶加入500 U γ-干擾素。置33℃、5%CO2培養箱孵育，細胞增殖傳代后，轉移入37℃、5%CO2培養箱（含有5 mL 10%FCS1640培養液，不加干擾素）分化成熟（細胞形態表現為“樹枝狀”）。

1.3.2 實驗分組 將分化成熟的足細胞接種至50 mL 細胞培養瓶，采用RandA 1.0軟件完全隨機分組法分為5 組，每組5 瓶細胞，對照組（Control Group：D-葡萄糖5 mmol/L）、高糖組（HG：D-葡萄糖25 mmol/L）、低TP組（LTP：25 mmol/L D-葡萄糖+8 ng/mL TP）、中TP組（MTP：25 mmol/L D-葡萄糖+16 ng/mL TP）和高TP組（HTP：25 mmol/L D-葡萄糖+32 ng/mL TP）。37℃、5%CO2培養箱孵育48 h后倒置顯微鏡下觀察足細胞形態變化，并檢測各組足細胞ILK、MMP9 和NEPH1的表達。

1.3.3 RT -PCR 半定量法檢測ILK、MMP9、NEPH1 RNA 表達 Trizol 試劑和氯仿抽提足細胞總 RNA ，微量核酸測量儀測定每個RNA樣品濃度（單位為μg/mL）；逆轉錄酶M-MuLV 催化下合成 cDNA；在DNA 自動擴增儀上進行 PCR 反應。25 μL反應體系中含10×buffer 2.5 μL，dNTP 0.5 μL，引物正反義鏈各10 pmol，TaqDNA 聚合酶（購自上海博亞）1.5 U，cDNA 1 μL，加去離子水至終體積25 μL，石蠟油封閉。陰性對照以雙蒸水替代cDNA。聚合酶鏈反應（PCR）引物均根據已知的小鼠ILK、MMP9、NEPH1和GAPDH 的基因序列由 PRIMER 5.0 引物軟件設計，由上海生物工程公司合成。見表 1。

1.3.4 擴增反應條件 在94℃ 2 min進行預變性后：（1）NEPH1：94℃30 s、55℃ 30 s、72℃ 30 s，進行35個循環。（2）ILK：95℃ 3 min，進入34個循環，94℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 60 s，進行34個循環。（3）MMP9： 94℃30 s、56℃ 30 s、72℃ 60 s，進行33個循環。（4）GAPDH：94℃ 30 s、59.8℃ 30 s、72℃ 30 s，進行25個循環。完成循環后，在72℃ 2 min進行終延伸。各PCR產物與DNA Marker（購自上海生物工程公司）在1.7%瓊脂糖凝膠（含0.5 μg/mL溴化乙錠），0.5%TBE液中電泳（100 V，30 min），用BIO-RAD凝膠成像系統成像，凝膠定量軟件Quantity-one分析其光密度值，以GAPDH為內參照基因，比較各目的基因條帶與內參照基因條帶的光密度比值。

1.4 統計學分析

采用SPSS 17.0統計學軟件，計量資料以均數±標準差（x±s）進行統計學描述，對高糖組與對照組行t檢驗，高糖組與其余各組行單因素方差分析（ANOVA），方差齊時，兩兩比較采用LSD檢驗，方差不齊時用Tamhane檢驗，α=0.05。

2 結果

2.1 小鼠足細胞的形態學改變

倒置顯微鏡（放大倍數400倍）觀察足細胞形態，發現對照組足細胞呈“分支狀”，分步均勻，細胞與細胞之間以“樹枝狀”足突相連，生長旺盛；高糖刺激48 h后，足細胞足突短少，局部聚集；低TP組可見足細胞形態尚可，足突較對照組短少，貼壁一般，生長尚可；中TP組足細胞足突較對照組少，但較高糖組多，細胞生長旺盛；高TP組足細胞形態尚可，足突粗短，部分細胞聚集。由封三圖1可見，對照組足細胞形態呈分化成熟的“樹枝狀”，生長旺盛，而高糖組足細胞足突短少，且有部分細胞死亡。與高糖組比較，細胞形態上，TP各組細胞足突均增多，尤以中TP組明顯；細胞生長方面，低TP組和中TP組細胞生長旺盛，高TP組細胞部分聚集，與高糖組相似。

2.2 對高糖刺激下足細胞ILK、MMP9、NEPH1 mRNA表達的影響

與對照組比較，高糖組ILK mRNA及MMP9 mRNA表達顯著升高（P<0.01），NEPH1 mRNA的表達顯著降低（P<0.01）。與高糖組比較，不同劑量的TP均能顯著降低ILK mRNA及MMP9 mRNA的表達（P<0.01），其中以中TP組的降低最明顯（P<0.01）。與高糖組比較，不同劑量的TP均能顯著上調NEPH1 mRNA的表達（P<0.01），其中以中TP組的升高最明顯（P<0.01）。見表2、3，封三圖 2、3。

3 討論

糖尿病腎?。―N）是糖尿病的主要并發癥之一，其特征性的臨床表現即蛋白尿，而蛋白尿的形成與腎小球濾過屏障功能和結構密切相關。足細胞EMT是影響腎小球濾過屏障功能的關鍵病理學變化，是引發早期蛋白尿的主要原因[8]。研究表明，通過抑制足細胞的EMT，可使足細胞能恢復至正常的上皮細胞表型[9]。

已發現的介導足細胞EMT的主要信號通路有TGF-β/smad、integrin/ILK和Wnt/β-acatenin三條。ILK信號通路中，ILK是一種存在于細胞胞質中的絲/蘇氨酸蛋白激酶，是參與細胞內外信號傳導通路形成的重要介質，調節細胞黏附、生存、分化和凋亡，在維持足細胞生物學特性上有重要意義[3]。ILK可與nephrin相互作用，從而建立起連接細胞-基質integrin信號通路與細胞-細胞信號通路的分子橋梁，可直接磷酸化下游幾個重要的激酶，包括Akt和GSK-313，導致β-catenin的穩定[10，11]。有研究發現激活的ILK能直接磷酸化糖原合成酶激酶-3（glyeogen synthase kinase-3，GSK-3），后者的磷酸化可激活活化蛋白-1（activatorprotein-1，AP-1），使MMP9的表達增加[12]。目前認為[13]ILK信號通路的失調，是引起慢性腎炎以及腎臟纖維化的重要原因。通過抑制ILK來達到延緩或逆轉EMT成為研究熱點。Huber MA等[14]通過研究體內給予ILK小分子抑制劑可減少白蛋白尿，能減少足細胞上間質細胞標志物α-SMA和MMP9的表達，恢復足細胞特異性標志物nephrin的表達，保護足細胞免受損傷，從而保護腎小球濾過屏障功能。

腎小球足細胞發生EMT后間充質細胞的表面標志物之一的MMP9，是以Ⅳ型膠原為主要降解底物的明膠酶。足細胞發生EMT時，MMP9的表達顯著增高，造成基底膜Ⅳ型膠原合成和分解失平衡，進而引發腎小球濾過膜、腎小球系膜病理學改變。

腎小球足細胞相關蛋白1（NEPH1）是一種在足細胞裂孔隔膜上表達的跨膜蛋白，具有組成濾過屏障和信號轉導等功能。它與nephrin有密切的相互作用，極可能與nephrin有同源性或相似性[15]。與nephrin類似，NEPH1能以相互交錯的形式形成拉鏈樣結構，起到分子屏障作用，是維持裂孔隔膜的完整性及濾過屏障的重要蛋白[16]。研究表明，NEPH1可以有效保護足細胞，防止損害。調節NEPH1的表達，已成為保護足細胞的治療新法[17]。

雷公藤制劑治療糖尿病腎病已在臨床上廣泛應用，而其作用機制尚需探討。已有研究證實，雷公藤甲素可上調高糖誘導的足細胞nephrine 和podocin mRNA及其蛋白表達[18]。此外，TP還通過調節Smad信號途徑減輕腎臟纖維化程度[19]。也有研究發現，TP能夠有效遏制p-38 MAPK信號通路的活化，顯著降低p-38 MAPK的磷酸化水平，從而保護足細胞[20-24]。然而，目前尚缺乏對TP調節ILK信號通路體外干預足細胞EMT的研究。本實驗通過研究其對高糖誘導下足細胞的ILK、MMP9、NEPH1的表達調節的影響，進一步了解雷公藤治療糖尿病腎病的機制。

本研究發現，在25 mmol/L高糖誘導下足細胞發生了EMT，表現為NEPH1表達明顯降低，而足細胞的ILK、MMP9的表達顯著升高，提示足細胞的EMT過程中，ILK通路被過度激活，使MMP9表達升高，破壞基底膜Ⅳ型膠原合成和分解平衡，影響了足細胞的結構穩定。使用不同劑量TP干預高糖誘導下的足細胞與高糖組比較，ILK、MMP9的表達均有不同程度的下調，NEPH1的表達則呈不同程度的上調；尤以中TP組（16 ng/mL）的表達變化最顯著。

本研究表明TP可通過有效降低ILK表達，抑制ILK信號通路的活性，從而減少ILK參與其他誘導足細胞EMT信號通路的影響，進而降低MMP9的表達，維持足細胞基底膜的完整性，同時上調受高糖影響而被抑制的NEPH1表達。提示TP可通過調節ILK、MMP9和NEPH1表達來抑制足細胞受高糖誘導的EMT，從而保護高糖環境下受損的足細胞，減少蛋白尿的產生，延緩糖尿病腎病的進展。而本研究提示以中劑量TP干預效果最明顯，并非呈劑量依賴性。高劑量TP的療效反而減弱，這是否與其細胞毒性有關，尚需進一步研究證實。

[參考文獻]

[1] Najafian B，Alpers CE，Fogo AB. Pathology of human diabetic nephropathy[J]. Contrib Nephrol，2011，170：36-47.

[2] Reidy K，Susztak K.Epithelial-mesenchymal transition and podoeyte loss in diabetic kidney disease[J]. Am J Kidney Dis，2009，54（4）：590-593.

[3] 牛洪琳，李英，劉茂東，等. 貝那普利對高糖培養下大鼠腎小球系膜細胞整合素連接激酶及平滑肌肌動蛋白表達的影響[J]. 中華腎臟病雜志，2013，29（1）：33-38.

[4] 夏璁，何靈芝. 雷公藤制劑治療糖尿病腎病研究進展[J]. 江西中醫藥大學學報，2015，27（1）：121-124.

[5] 張曉慧，楊恩才，萬春平. 雷公藤內酯醇及其衍生物的藥理作用研究進展[J]. 云南中醫中藥雜志，2013，34（8）：64-65.

[6] 鄭春霞，劉志紅，孫吉平，等. 雷公藤甲素對嘌呤霉素模型足細胞病變的影響[J]. 腎臟病與透析腎移植雜志，2007，16（2）：110-118.

[7] 秦衛松，劉志紅，曾彩虹，等. 雷公藤甲素對Heymann腎炎模型足細胞病變的影響[J]. 腎臟病與透析腎移植雜志，2007，16（2）：101-109.

[8] Gnudi L. Cellular and molecular mechanisms of diabetic glomerulopathy[J]. Nephrology，Dialysis，Transplantation：Official Publication of the European Dialysis and Transplant Association-European Renal Association，2012，27（7）：2642-2649.

[9] Sam R，WananL，Gudehithlu KP，et al. Glomerlular epithelial cells transform to myofibroblasts：Early bat not late removal of TGF.Betal reverse transformation[J]. Transl Res， 2006，148（3）：142-148.

[10] Hannigan G，Tmussard AA，Dedhar S. Integrin-linked kinase：A cancer therapeutic target unique among its ILK[J].Nat Rev Cancer，2005，5（1）：51-63.

[11] Han SY，Kang YS，Jee YH，et al. High glocose angiotensin Ⅱ increase betal integrin and integrin-linked kinase synthesis in cultured mouse podocytes[J]. Cell Tissue Res，2006，323（2）：321-332.

[12] PiekE，Moustakas A，Kurisaki A，et al. TGF-（beta） type Ⅰreceptor /ALK-5 and Smad Proteins mediate epithelial to mesenchymal transdifferentiation in NMuMG breast epithelial cells[J]. J Cell Sci，1999，112（Pt24）：4557-4568.

[13] Wu H，Ren Y，Pan W，et al. The mammalian target of rapamycin signaling pathway regulates myocyte enhancer factor-2C phosphorylation levels through integrin-linked kinase in goat skeletal muscle satellite cells[J]. Cell Biol Int，2015，39 （11）：1264-1273.

[14] Huber MA，Kraut N，Beug H. Molecular requirements for epithelial mesenehrmal transition during tumor progression[J]. Curt Opin Cell Biol，2005，17（5）：548-558.

[15] Donoviel DB，Freed DD. Proteinuria and perinatal lethality in mice lacking NEPHI，a novel protein with homology to NEPHRIN[J]. Mol Cell Biol，2001，21（14）：4829-4836.

[16] Liu G，Kaw B.Kurfis J，et al. Nephl and nephrin interaction in the slit diaphragm is an important determinant of glomerular permeability[J]. Clin Invest，2003，112（2）：209-210.

[17] Arif E，Rathore YS，Kumari B，et al. Slit diaphragm protein Neph1 and its signaling：A novel therapeutic target for protection of podocytes against glomerular injury[J]. J Biol Chem，2014，289（14）：9502-9518.

[18] 葉迅. 雷公藤內酯醇對小鼠腎小球足細胞裂孔隔膜核心蛋白表達干預作用的研究[J]. 浙江醫學，2013，35（16）：1490-1493.

[19] Qing G，Wenwen S，Weisong Q，et al. Treat of db/db diabetic mice with triptolide：A novel therapy for diabetic nephropathy[J]. Nephrol Dial Transplant，2010，25（11）：3539-3547.

[20] 陳朝紅，劉志紅，洪亦眉，等. 雷公藤甲素干預C5b-9誘導足細胞損傷的體外研究[J]. 腎臟病與透析腎移植雜志，2009，18（4）：310-317.

[21] 樊壘壘，王幼平. 雷公藤多苷的抗炎作用研究進展[J]. 中國現代醫生，2016，54（8）：161-164.

[22] 孫慧，李彩萍. 雷公藤多苷聯合二甲雙胍治療糖尿病腎病臨床觀察[J]. 西部中醫藥，2014，27（7）：82-84.

[23] 馮四平，王治國，安文軍，等. 雷公藤多苷片輔治原發性膜性腎病的療效及對凝血纖溶系統、內皮細胞功能的影響[J]. 疑難病雜志，2015，14（5）：472-475.

[24] 周振中. 小劑量強的松聯合雷公藤多苷治療老年原發性腎病綜合征的臨床療效觀察[J]. 現代診斷與治療，2015， 26（21）：4860-4861.

（收稿日期：2016-07-11）