金釵石斛轉錄組SSR位點信息分析

李清+李標++郭順星

[摘要]SSR是應用于金釵石斛鑒定和遺傳多樣性研究的重要分子標記之一。為開發新的SSR標記，尋求快速鑒別金釵石斛的方法，該文通過生物信息學手段對金釵石斛轉錄組序列進行SSR位點搜索、分析，并設計出SSR特異性引物。結果顯示，從金釵石斛轉錄組中搜索到32 709個SSR，分布與26 742條unigenes中，SSR位點發生頻率為1290%，平均每 3 748 bp含1個SSR 位點。其中，單核苷酸是最主要重復類型，占SSR總數的7218%，其次是二核苷酸和三核苷酸，分別占SSR總數的1597%，1119%。而在所有重復基元中，A/T出現頻率最高，AG/CT次之。通過設計、篩選，該研究共獲得 62 157對SSR位點特異性引物。從中隨機挑選20對引物進行PCR擴增，17對擴增出清晰、可重復的條帶，擴增率為850%。選擇3種石斛檢測引物多態性，共獲得多態性引物13條。以上結果表明，金釵石斛轉錄組測序產生的unigenes信息可作為開發SSR標記的有效來源，其中的SSR位點出現密度大、類型豐富、多態性潛能高，在金釵石斛及其近緣種的分子鑒定、遺傳多樣性與分子育種等方面具有較好的應用前景。

[關鍵詞]金釵石斛； 轉錄組； SSR； 位點信息

又名金釵石、扁金釵、扁黃草、扁草等，為蘭科Orchidaceae石斛屬Dendrobium Sw多年生附生草本植物，也是歷史上記載最早的石斛習用種類[1]。其新鮮或干燥莖入藥具有益胃生津、滋陰清熱等功效，在《神農本草經》中列為上品，并作為藥用石斛最重要的基原藥材被收錄于歷代《中國藥典》。金釵石斛是傳統中成藥石斛夜光丸、石斛明目丸、石斛清胃散以及現代中成藥脈絡寧注射液、復方“清咽寧”等的重要配伍成分，具有巨大的市場需求和經濟價值。而現代藥理學研究發現金釵石斛還具有改善記憶、抗氧化、抗腫瘤等重要功效，藥用開發前景不可估量[24]。

然而，由于長期的過度開采和生境破壞，金釵石斛野生資源遭到嚴重的破壞，幾近枯竭。日漸突出的供需矛盾，使市面上金釵石斛混淆品的泛濫現象不斷加劇。據報道，市場上常有將蘭科石豆蘭屬、金石斛屬和石仙桃屬等數十種植物作為藥用石斛混入商品流通的現象[5]。以非適產地的劣質石斛充當優質金釵石斛的現象屢見不鮮。而對于大部分人工栽培的金釵石斛，其確切的種源地無法考證、遺傳背景認識不清等問題更是久存不解。如此種種，嚴重影響了金釵石斛的藥效質量和開發利用，尋找高效、便捷的鑒別方法迫在眉睫。

近年來，隨著分子生物技術的發展，分子標記逐步應用于金釵石斛藥材鑒別和種質資源研究中，其中SSR（simple sequence repeats，簡單重復序列）標記憑借其多態性高、可重復性強、共顯性等優點，成為金釵石斛重要的分子標記之一[6]。然而，由于傳統的SSR標記開發過程繁瑣、工作量大，費用高，現階段針對金釵石斛的SSR系統研究還比較少，已開發的金釵石斛SSR 標記也僅198對，難以滿足研究的需求。所幸的是，隨著新一代測序技術的發展，從轉錄組數據中大規模開發SSR標記成為可能。目前，該技術已成功應用于地黃[7]、莢膜黃芪[8]等藥用植物的SSR標記開發過程中?；诖?，本文將首次對金釵石斛轉錄組數據中的SSR位點進行檢測，分析其分布、組成特征，并初步評價其可用性，設計SSR引物，旨在豐富金釵石斛的分子標記庫，為金釵石斛的分子鑒定、遺傳多樣性研究及分子育種提供有效的工具。

1材料與方法

11金釵石斛轉錄組數據來源本實驗轉錄組測序樣本來源于貴州赤水的金釵石斛組培苗，提取莖RNA后送北京諾禾致源生物信息科技有限公司，利用Illumina HiSeq 4000高通量測序平臺對其進行轉錄組測序，最終獲得207 283條unigenes。

12金釵石斛轉錄組SSR的篩選使用MISA （http：//pgrc ipkgatersleben de/misa/Misa html） 對金釵石斛轉錄組中的SSR位點進行搜索和定位。搜索的標準為單核苷酸重復至少10次，二核苷酸至少重復6次，三至六核苷酸至少重復5次；同時篩選被間隔小于或等于100 bp堿基打斷的復合型 SSR。

13金釵石斛SSR引物設計調用 Primer 30引物批量設計程序對含有 SSR位點的兩端序列設計引物，每條SSR序列產生3條引物。主要的引物參數設置為：退火溫度（Tm）在57～63 ℃，上、下游引物的Tm相差不大于5 ℃；擴增產物大小在100～280 bp；引物長度 在18～27 bp；GC量在40%～65%。將設計出的引物通過以下方式篩選：引物不能存在SSR；將獲得的引物比對到unigene序列，引物的5′端允許有3個堿基的錯配，3′端允許有1個堿基的錯配；去掉比對到不同unigenes上的引物，篩選唯一匹配的引物；使用SSRFinder校驗SSR，使用產物序列來尋找SSR，檢驗結果是否與MISA 結果相同，并篩選出相同的SSR產物。

14金釵石斛SSR引物PCR擴增隨機選擇合成20對引物（蘇州金唯智生物科技有限公司），并提取金釵石斛、鐵皮石斛、霍山石斛葉片DNA（北京艾德萊生物科技有限公司，CTAB植物基因組DNA快速提取試劑盒）。PCR擴增反應在Eppendof Mastercycle 梯度PCR儀上進行。

25 μL的PCR反應擴增體系：Taq PCR Master Mix （2×）125 μL，10 μmol·L-1上下引物各1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O補足至25 μL。PCR擴增程序為94 ℃ 預變性5 min，95 ℃ 變性1 min，最佳Tm退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環，72 ℃延伸5 min。擴增產物用3%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2結果與分析

21金釵石斛SSR數量與分布對金釵石斛轉錄組測序獲得的207 283條unigenes進行檢索，共在26 742條unigenes中找到符合條件的32 709個SSR。SSR發生頻率（含有SSR的unigenes數目與總unigenes數目之比）為1290%，出現頻率（檢出SSR個數與總unigenes數目之比）為1578%。其中28 061條unigenes含單個SSR 位點，4 648條unigenes含2個及2個以上SSR 位點。復合型SSR數目為1 572個。

金釵石斛轉錄組中，SSR 的主要重復類型是單核苷酸，占SSR總數的7218%，二核苷酸和三核苷酸次之，分別為1597%，1119%，四、五、六核苷酸重復的數量極少，總計067%。從分布情況看，金釵石斛轉錄組中平均每3 748 bp 就含有1個SSR位點。但不同重復基序長度SSR分布的平均距離差距很大，其中單核苷酸重復最多，分布平均距離519 kb/SSR，五核苷酸重復最少，每條SSR分布平均距離7 66306 kb （表1）。

李清等：金釵石斛轉錄組SSR位點信息分析表1金釵石斛轉錄組SSR不同重復基元分布情況

金釵石斛轉錄組中共搜索到189種不同基序序列類型的SSR，單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復分別有4，12，60，77，16，20種類型。從出現頻率來看（圖2），占絕對優勢的重復基元類型是單核苷酸A/T，為總SSR 數目的7068%，其次是AG/CT和AT/AT，分別占總SSR數目的1104%，343%。在三核苷酸重復基元中以AAG/CTT數目最多，占總SSR 數目252%。其他四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸重復基元類型分布較少，出現頻率較低。

金釵石斛轉錄組被分為3個區域，分別是5′非編碼區、3′非編碼區和蛋白編碼區（表2）。其中非編碼區域的SSR數目最多，為編碼區SSR位點數目的1689倍。這一結果與之前的研究，認為編碼區對移碼突變的選擇性會限制SSR的擴張的結論相一致[9]。從理論上分析，來自非編碼區域的SSR面臨的選擇壓力較與來自編碼區域的要小，具有比較高的多態潛能。在本研究中，5′和3′非編碼區的SSR位點數目都顯著高于編碼區序列，預示著金釵石斛轉錄組中的SSR位點具有較高的多態性潛能。

對金釵石斛轉錄SSR位點在非編碼區和編碼區的分布情況進一步研究發現，三核苷酸的整倍體，例如三核苷酸SSR和六核苷酸SSR，其出現在編碼區域的概率更大，分別占已確定分布位置的該類型SSR數目的3690%，50%，遠高于單核苷酸的327%及五、六核苷酸的0%。產生這一現象的原因可能是三核苷酸重復產生的是非編碼突變，其導致的危害相對較小。但在編碼區域內，增加或減少非整倍體三核苷酸往往會導致編碼框移碼和面臨較大的選擇壓力[10]。同時，本研究還發現AT富含基元比較容易出現在3′非編碼區，例如6463%的已知A，7222%的已知AT和7407%的AAT落入3′非編碼區。這很可能與AT富含基元在3′非編碼區作為一些順式元件出現相關，例如多聚腺苷酸（polyA）結尾信號的AAUAAA，其關系到mRNA的穩定[11]。

22金釵石斛SSR的可用性評價SSR分子標記多態性是評判其可用性的重要依據。SSR長度是影響其多態性高低的重要因素，當SSR長度大于或等于20 bp 時多態性較高，長度在12 ～ 20 bp 的SSR 多態性中等，而長度在12 bp以下時多態性極低[12]。本研究中，具中等多樣性（長度在12 ～ 20 bp）的SSR有14 718條，占SSR總數的4500%；具較高多樣性（長度大于或等于20 bp）的SSR有2 842條，占SSR總數的869%。換言之，超50% 的SSR位點具有中等水平以上的多樣性。此外，低級基序SSR往往比高級基序SSR更容易滑動而產生多態性[13]。而本研究中20 bp 以上的低級重復基元（單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸）較多，共1 181條，占20 bp以上SSR總數的4156%。由此可預見金釵石斛轉錄組來源的SSR 具有較高的多態性潛能，在分子標記研究方面具有較高的利用價值。

23金釵石斛SSR引物設計為更好的應用金釵石斛SSR位點，本研究應用Primer 30軟件對上下游序列均不小于150 bp的SSR 設計引物，每條序列產生3對引物。經SSRFinder校驗和除去不符合條件的引物后，共為20 719條SSR序列設計出62 157對SSR位點特異引物，占到金釵石斛SSR總數的6334%。其中針對20 bp以上且包含低級基序（單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸重復）的SSR序列共設計出552對引物。

24金釵石斛SSR引物評價分析為檢測新發掘的金釵石斛SSR位點特異引物的可靠性，隨機挑選20對不同重復單元（一、二、三、四、五、六核苷酸）的引物對金釵石斛DNA進行PCR擴增（表3），結果顯示，17對引物在金釵石斛中成功擴增，引物擴增率為850%。其中12對PCR擴增產物與預期大小吻合，5對引物擴增產物長度超過預期（圖3A），說明本研究所設計的大部分引物真實可靠。

與此同時，利用該20對引物對金釵石斛近緣種鐵皮石斛和霍山石斛的DNA進行擴增，結果證明金釵石斛SSR引物在石斛種間的通用性良好，17對在金釵石斛中成功擴增的引物在鐵皮石斛和霍山石斛表3金釵石斛SSR引物序列

而通過比較3種石斛DNA的擴增結果發現（圖3A，B，C），20對引物中，13對引物呈現多態性，多態性位點比率達650%。13對多態性引物共得到39個擴增片段，其中多態性片段32個，每對引物平均產生246個多態性片段，可見SSR引物具有較高的多態性，具有足夠的潛力在石斛鑒定、居群間多樣性評價和系統發育關系的研究上得到應用。

3討論

本研究大規模地從金釵石斛轉錄組中檢測出32 709個SSR位點，分布于26 742條unigenes中。由于目前對SSR的定義沒有一個統一的標準，采用的分析方法和最小長度定義的不同，使獲得的整個轉錄組中SSR的數量也存在較大的差異。選擇分析方法相近的轉錄組SSR進行對比發現，金釵石斛轉錄組SSR出現頻率為1578%，顯著高于云南松（307%）[14]、茯苓（532%）[15]、燈盞花（699%）[16]，而與金線蓮（1222%）[17]，建蘭（1754%）[18]相差不大。這說明金釵石斛轉錄組具有豐富的SSR位點，可為SSR的開發提供重要的資源庫。同時也可以看出親緣關系近的物種間SSR豐度更為相近。而對金釵石斛轉錄組SSR位點類型分析發現，短重復單元（單核苷酸至三核苷酸）的數量要比長的重復單元數量要多，與大多數物種中的分布情況一致，支持了長的重復單元的SSR具有較高可變性的觀點。

SSR的多樣性與不同基序序列類型存在一定關系，如由于打破AT鍵所需的能量低于GC堿，AT的波動較GC容易，SSR的基序類型中存在A/T優勢[19]。在本研究中，從不同核苷酸類型的堿基組成分析可知，金釵石斛轉錄SSR中A/T，AAAT/ATTT分別是單核苷酸、四核苷酸的優勢重復基元，AT/AT及AAT/ATT的數目分別在二核苷酸和三核苷酸中排名第二和第三，表現出了明顯的A/T優勢。相反G/C在基序中的出現頻率很低，C/G和CG/CG在單核苷酸和二核苷酸中所占的比例均小于220%。這很好的驗證了上述觀點。但也有觀點認為A/T優勢的出現是由于甲基化的C殘基轉化為T及位于3′末端的polyA序列插入基因組后形成富含A的原始SSR序列所致[2021]，具體原因有待進一步考究。

Weber等[22]將SSR分為3類，分別是完全由單一的核苷酸重復組成的完美型，由單一重復基元組

M50 bp Maker ZM201（從上至下依次為400，350，300，250，200，150，100，50 bp）；A金釵石斛；B鐵皮石斛；C霍山石斛。

成，但中間被少量非重復基元核苷酸隔開的非完美型，以及由2種或2種以上重復基元組成的復合型。分型研究發現，金釵石斛轉錄組中SSR位點以完美型為主，占總SSR位點數目的9519%。由于非完善型和復合型SSR常常代表著序列之間存在較多的插入、缺失、堿基置換等基因突變，可以推測金釵石斛轉錄組SSR位點具有較高的可靠性，在遺傳分析方面具有較大的潛力。

SSR位點的可靠性還體現在其較高的有效擴增率和多態性。在本研究中，除少量可能是由于所設計的引物序列位于2個外顯子上，或者基因組對應的序列含有內含子而不具備SSR序列特征等原因[23]造成的擴增失敗外，所有候選引物均獲得有效擴增，擴增率為850%，屬于較高的擴增水平。而通過比較引物在金釵石斛、鐵皮石斛和霍山石斛3種不同石斛中擴增情況，可發現13對引物呈現多態性，多態性位點比率為650%。值得注意的是，本研究僅采用瓊脂糖凝膠電泳對SSR的多態性進行初步的分析，如采用高分辨率的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，呈現多態性引物的比例將會更高，由此可見SSR的多態性相當豐富，對石斛具有良好的鑒別能力，可作為品種資源鑒定的一個輔助工具。

SSR除了作為一種分子標記外，還具有功能上的意義，包括它在染色體組織上的影響，對基因活性、DNA復制、細胞周期和糾錯修復系統的調節等等[2425]。通常，可以根據SSR所在位置初步判斷它的功能，分布在5′非編碼區的SSR可以調節基因的表達，分布在3′非編碼區的SSR可以導致轉錄滑移[26]。在金釵石斛轉錄組中，分布在5′和3′非編碼區的SSR數量豐富，分別是2 131，3 357個。它們其中的部分可能對調節基因的表達活性起到一定的作用，對其進一步的深入研究，使無功能分子標記向可揭示基因轉錄功能的分子標記轉化，將有利于金釵石斛功能基因資源的定位和開發利用。

總體而言，金釵石斛轉錄組SSR不但出現頻率高，且類型豐富，具有較高的多態性潛能和可用性?；谵D錄組的SSR分子標記開發充分利用了轉錄組測序的結果，不僅保留了基因內部SSR的特異性和高保守性的優點，大大降低了開發成本，還避免了基因組SSR周期長、操作繁瑣，以及ESTSSR的數據量少的缺點，為進一步豐富的金釵石斛SSR標記奠定了堅實的基礎，為金釵石斛的遺傳資源評價、種質資源改良、物種鑒定等提供了重要的參考依據。

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