miRNA在農作物研究中的應用進展

韓霜　王曉丹　肖鋼　李瑞蓮　張振乾　鄔賢夢　陳浩

摘要 miRNAs是內源的小分子RNA，在生物體生長發育、生物體代謝途徑以及抵抗生物或非生物脅迫中起著非常重要的作用。綜述了miRNA在水稻、玉米、油菜、棉花等主要農作物生長發育的調控的應用研究進展，最后探討了miRNA未來研究熱點，并對其在農作物研究中的應用前景進行了展望。

關鍵詞 miRNA；農作物；應用；研究進展

中圖分類號 S5；Q522 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2016）21-0014-03

miRNAs（microRNA）在生物體生長發育、生物體代謝途徑以及抵抗生物或非生物脅迫中起著非常重要的作用[1-2]。miRNA是內源的小分子RNA，約占整個真核生物基因組基因總數的2%，能通過RNase Ⅲ的Dicer酶和/或α蛋白家族的精確剪切，產生具有反向重復的轉錄物[3]。植物miRNA通過與 RNA誘導沉默復合體（RISC）結合，切割靶mRNA，介導靶DNA甲基化抑制靶mRNA的翻譯或來調控基因的表達[4-5]，在植物生長素信號、葉片發育、花器官形成等生命活動、細胞內基因表達調控及植物響應干旱、低溫等逆境生理過程中發揮重要的調控作用[6-8]。

研究植物中miRNA功能的方法有如下幾種：一是生化與分子生物學方法測定miRNA指導下mRNA的剪切反應的精確位點，該方法可將miRNA與其調控的生化反應聯系在一起[4-5]；二是導入抗miRNA的靶基因，使原本被miRNA抑制的基因得到表達，植物的表型變化就可反映出miRNA的功能；三是通過上調miRNA的表達，然后從表型的變化分析miRNA的功能。綜述了該技術在農作物研究中的應用，以期為農業科研研究提供參考。

1 在主要農作物研究中的應用

水稻、玉米、油菜、小麥等作為重要的糧食作物，miRNA在這些作物中生長發育起著重要的作用。

1.1 在水稻研究中的應用

水稻是全球第二大糧食作物，miRNA的發現補充了研究人員對水稻基因調控機制的理解。

1.1.1 水稻生長發育的調控。Zhu Q等[9-11]研究表明，植物miRNA通過與靶基因的序列互補造成靶基因的降解或翻譯的阻斷，從而實現對內源基因的負調控。在miRNA代謝途徑中，核酸酶Dicer和PPD家族蛋白Argonaute對于miRNA的合成發揮作用。

1.1.2 根的發育。在植物中，Meng Y等[12]對miRNA介導的生長素信號途徑進行了深入研究，如miR164、miR160等通過生長素應答因子（ARF）影響植物不定根的發生、側根的發育及根冠的形成。Meng Y等[12]研究證明，水稻中存在著miR390-TAS3-ARF2/ARF3/ARF4和miR167-ARF6/8-CH3通路來調控根的發育。此外，Bian H等[13-14]發現過表達 miR393導致靶基因AFB2（Auxin signaling F-BOX）和TIR1（transport inhibitor response 1）的表達水平下調，出現了水稻根冠和主根增長的表型。

1.1.3 花的發育。Yamaguchi等[15]研究表明，AP2（Apetala2）基因調控花序分生組織向花分生組織的轉變，參與花器官的形態發育。Peng等[16]研究發現了miRNA在雄配子體發育過程中的作用機制，并證明miR167和miR160能夠切割5種生長素應答因子ARF，這些ARF在花粉母細胞發育到二孢花粉粒的過程中高度表達。Zhu Q等[9]研究發現，miR172可以調控AP2基因，控制水稻花的發育。

1.1.4 幼穗的發育。Peng H等[16-17]研究發現，過表達OsSPL14的轉基因水稻在生殖期促進幼穗的分支，并提高水稻產量，而 miRNA156不能切割突變后的OsSPL14，突變水稻從而表現出產量提高、抗倒伏等性狀。Tong H等[18-19]研究表明，miRNA397通過下調編碼漆酶蛋白的OsLAC基因的表達。

1.1.5 分蘗。過表達miR393的轉基因水稻中出現分蘗數增加，同時水稻分蘗抑制因子OsTB1、生長素轉運因子OsAUX1 以及生長素受體因子（TIR1和AFB）表達水平均下調。據此推測，miR393的過表達可能通過抑制生長素轉運因子和生長素受體因子的表達，抑制了腋芽處分蘗抑制因子OsTB1的表達，最終引起分蘗的增加[10]。

1.1.6 種子發育。Lu S等[9，19]研究表明，在水稻種子發育相關的調控網絡中，miRNA通過控制營養物質的合成和運輸發揮重要的作用。

1.1.7 胚的發育。Bian H等[13，16]研究培養水稻愈傷組織時發現，miR156、miR397等miRNA在愈傷組織中表達水平較高，在水稻愈傷組織中miR156也可能是通過負調控OsSPL的表達，加快水稻胚的發育和細胞分裂。Xie K等[20]研究表明，miR160通過調控靶基因ARF17，造成異常胚胎對稱。

1.2 在玉米研究中的應用

1.2.1 籽粒。Chuck G等研究發現 miRl68是下調表達，其靶基因是上調表達，miRl68的顯性抑制可能抑制其他miRNAs靶基因[21]。各種因素相互調控，使玉米雜交種最終表現出優于親本的雜種優勢。

1.2.2 根。Zhang等利用Solexa測序的方法對冠根miRNAs的測序發現，miR528在冠根中具有最高的表達量但在總根中表達量很低[22]；mil59、164、167、169、319和396家族在總根中表達量很高；miR156、166、167和168家族在玉米苗期總根大量表達；由此說明miRNAs的表達豐度在不同類型的根中存在顯著差異。Zhang L F等[23-25]研究發現，玉米中miR166的靶基因是HD-ZIP III基因，能夠調控側根生長及種子成熟。

1.2.3 穗。張志明等[21]利用生物信息學挖掘玉米中的microRNA及其靶基因，通過與玉米EST 和GSS數據庫的比對，共篩選到23條新的玉米miRNA。陶家風等[22]以對紋枯病抗性不同的自交系R15和掖478為研究對象，初步探討miRNA與玉米抗真菌病害調控機制存在明顯的關系。唐朝榮等[22，26]推測miR171與細胞壁的抵抗能力有關聯。

Lauter N等[27]發現miR172已被證明能夠下調基因光澤15，促進幼穗階段的維持。同時，Mallory等[28-31]研究miR172e可能會控制無限小穗1和姊妹無限小穗1，通過翻譯抑制和mRNA降解方式，對玉米莖尖細胞分化和小穗性別起決定作用。Allen E等[32-33]也發現，miR390通過切割反式作用干擾小RNA產生多片段，這些片段在一系列RNA酶作用下，參與植物生長發育的調控。

1.2.4 花瓣。Aukferman等[34]研究發現，在玉米中miR156 a-1從玉米幼穗至成熟過渡階段可能作用于幾個Squamosa啟動子結合蛋白基因，可能是通過SPL間接地激活miR172；miR172功能的缺失將延遲花的發育或造成花發育異常，相比之下，過表達的miR172將導致花期提前。

1.3 在油菜研究中的應用

1.3.1 灌漿。Yi R等[35]研究發現，miR164介導的生長素調控機制能夠調控種子灌漿。

1.3.2 胚胎。Zhao等[36]研究發現，miR390通過反式作用反干擾小RNA介導的生長素信號轉導途徑，參與了油菜早期胚胎的發育過程。

1.3.3 花瓣。Zhang Y等[37]也發現MADS-box因子在甘藍型油菜花瓣形成中扮演了重要的角色，miRNA靶基因也在抗生物和非生物脅迫反應中發揮著重要的作用。此外，還參與F-box蛋白、plantacyanin 類蛋白（參與生殖和結實）和激素刺激蛋白降解（TIR1-like）的漆酶（細胞壁代謝酶）等。過表達Bna-miR1140甘藍型油菜株系表現開花推遲、分枝增多，表明其參與調控甘藍型油菜生長發育。

1.3.4 穗。Peng T等[38]研究發現，miR164是生長素相關的miRNA，存在于水稻劣質穗和優質穗中，且在優質穗中表達量更高。miR164通過靶向NAC轉錄因子，調節植物內部生長素平衡。

1.3.5 葉片。Han等[39]研究了甘藍型油菜旗葉和發育中的種子，一共有2 869個miRNA調控3 491個靶基因，而白菜中2 910個miRNA對應著4 591個靶基因，平均每個miRNA對應的靶基因數目分別為1.2和1.6。在多倍體化后，每個miRNA的調控的靶基因的數目明顯增加，增強了多倍體物種的基因表達的調控的復雜性。已知的miRNA與新的miRNA調控的靶基因數目進行比較，后者是前者的3倍多，說明新的miRNA調控靶基因更復雜。Addo-Quaye C等[40]利用混合的甘藍型油菜根、莖、葉柄、葉片中RNA樣進行高通量測序，共獲得包含有自由的5′單磷酸和3′polyA尾巴的 -20 ntRNA序列8 356 060條。

1.3.6 分枝。Fu Liang Xie等[41]研究miRNA參與調控油菜分枝形成和發育的遺傳控制機理，可以完善高等植物發育生物學的理論基礎。

1.3.7 分子生物學研究。Addo-Quaye C等[40-42]前人研究表明，植物體內絕大多數的miRNA是利用剪切作用調控靶基因的表達，且剪切常發生在miRNA 與mRNA互補區域的第10位核苷酸上，因此在mRNA序列的某個位點出現的波峰是候選的 miRNA剪切位點。Addo-Quaye C等[43]發現，大多已知的保守甘藍型油菜miRNA靶基因屬于不同家族的轉錄因子，諸如NAC域蛋白、NF-Y亞基、SPLs、ARFs、MYBs、MADS-box factors、SCLs、AP2-like factors。這些轉錄因子大多已被發現通過不同途徑參與調控植物的生長和發育。

1.4 在小麥研究中的應用

韓 冉等[44]在known miRNA中，miR160、miR164、miR166和miR169在籽粒中偏愛性表達，miR164和miR160的豐度在5、10、20 d籽粒依次升高，而miR169的豐度卻依次降低，說明不同miRNA在籽粒發育各個階段協調地發揮著不同的功能。Tang Y等[45]發現MiR164在5-d seed 中的豐度為135，但在20-dseed的豐度為244，這種差異說明miR164在小麥籽粒發育過程中具有一定的作用。在Uauy C等[46]研究發現，miR168是總豐度最高的miRNA，且在各個組織中的表達差異也比較大。

2 前景展望

miRNAs是內源的小分子RNA，處于基因表達調控的網絡核心位置。在油菜、水稻等農作物的根、花等器官發育方面發揮重要的調控作用，對作物的產量、品質改良有很重要的參考價值。

目前已經取得了廣泛的研究，近年來，越來越多與種子發育相關的miRNA通過降解組測序、大規模平行測序、基因芯片等技術在多種植物中得到鑒定。參與種子發育的miRNA 及其靶基因目前已得到廣泛的研究。

未來的研究熱點：高通量測序技術[40-43]對miRNA作用的靶基因篩選有很好的促進作用，結合生物信息學分析優勢，確定降解片段與miRNA精確的配對信息。目前，在miRNA的調控機制方面的研究很少，因此今后研究的重點可能集中在此，利用miRNA研究改良作物的品質和產量也將是今后研究的熱點和重點。

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