普洱茶中微生物研究進展

季愛兵　龔婉瑩　彭文書　劉聰　曾胤　嚴亮

摘要 普洱茶的發酵離不開微生物。對目前普洱茶加工與微生物的關系，普洱茶發酵微生物的研究方法和已發現微生物的種類以及優勢菌種對普洱茶品質的影響進行了綜述，指出應用高通量測序技術研究普洱茶從原料鮮葉到普洱茶成品整個過程中微生物種群變化的必要性，以便更加深入地了解普洱茶中微生物種群的消亡規律及其對普洱茶品質的影響。

關鍵詞 普洱茶；發酵；微生物

中圖分類號 S571.1 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2016）21-0253-03

普洱茶是以云南大葉種曬青毛茶為原料經后發酵加工而成緊壓茶或散茶，普洱茶又按照其加工工藝將其分為普洱生茶和普洱熟茶。普洱熟茶是曬青毛茶經潮水、渥堆，經渥堆過程中物質變化是由微生物、酶、濕熱、氧化等綜合作用的結果，因其經過人工后發酵以區別于普洱生茶。

近年來，隨著對普洱茶的深入研究，證實了普洱茶具有抗氧化、抗腫瘤、降血脂和降血糖等功效[1-4]。曬青毛茶不經過微生物的發酵難以形成普洱熟茶所特有的香氣和湯色，一般認為微生物或微生物酶的濕熱作用對普洱茶品質的形成起著決定性作用[5-7]。

1 普洱茶加工方式與微生物

普洱茶鮮葉采摘經萎凋后，進行殺青，再揉捻，后曬干制得曬青毛茶。再由曬青毛茶加工得到普洱茶，其具體制作工藝流程如圖1所示。

將曬青毛茶經人工增濕渥堆快速發酵而制成普洱熟茶[8]。普洱熟茶的加工方式借鑒于安化黑茶，但又不同于安化黑茶。其主要的不同在于普洱茶經過曬青毛茶這一步，而安化黑茶從揉捻到后發酵不經過干燥過程，再焙火干燥[9]。

普洱茶與紅茶的發酵方式相比，普洱茶的發酵與紅茶有些相似，都有茶多酚經氧化生成茶紅素和茶褐素的過程，不同之處在于紅茶發酵僅需要3～4 h，而普洱茶發酵所需時間較長，渥堆時間至少需要3～4周。因為紅茶發酵時間短，所以微生物作用較少，主要是生物酶的作用，而普洱茶的發酵與微生物的作用是分不開的。

普洱原料曬青毛茶就有大量的內生菌，曬青毛茶又長期暴露在空氣中，在研究中發現很多發酵過程中的微生物都在普洱茶鮮葉中[10]和茶園空氣中[11-12]都有發現。普洱茶渥堆時，剛開始溫度由室溫緩慢升高，其潮水量常達到40%左右，堆溫一般保持在28～55 ℃，非常適合微生物的生長。在發酵過程中，肉眼可見真菌菌絲。一般認為，普洱茶的加工過程離不開微生物的作用，普洱茶的品質與微生物的消亡有密切關系。

2 參與普洱茶發酵過程的微生物研究方法

2.1 微生物的傳統分離鑒定

研究微生物學的傳統方法是將茶葉與無菌水按一定比例進行均質，然再做梯度培養，以此來初步了解渥堆發酵中普洱茶中微生物數量，然后對分離得到的微生物進行純培養，以更好地進行菌種鑒定或保藏。鑒定方法主要為形態學鑒定或根據生理生化性狀，一般將結果與標準分類系統中微生物形態或生理生化性狀進行對比[13]。該方法是研究微生物的主要方法，已成功證實普洱茶中確實存在細菌、酵母、霉菌和放線菌[14-28]。

2.2 微生物自動鑒定系統

鑒于微生物傳統鑒定方法的缺陷如工作量大，不利于操作，還受限于鑒定者的專業知識和認知能力。傳統鑒定方法還常常受培養條件的限制，很多微生物不能在培養基上被分離培養出來，造成了鑒定種群不夠完整，使得人們無法全面了解普洱茶發酵過程中的微生物種群情況，多數只是鑒定到了優勢菌種或是在一定的培養條件下表現為優勢的菌群。

近年來微生物快速鑒定儀更多地應用到微生物鑒定工作來，該系統是將微生物與底物反應的生化類型與已知建立的數據庫中的類型比較，使微生物鑒定更加快速、準確。Mo等[20]利用API ID 32C和API ID 50 CHL微生物快速鑒定系統對普洱茶發酵過程中的微生物進行鑒定，發現了多種酵母和細菌。但由于該系統是根據現有數據庫中所提供的背景資料進行微生物鑒定，數據庫資料會影響微生物鑒定的種類及準確性。

2.3 分子生物學方法

PACE N R的研究表明，傳統分離方法鑒定的微生物只占環境微生物總數的0.1%～10.0%[29]，傳統鑒定方法還常常受培養條件的限制，很多微生物不能在培養基上被分離培養出來，造成了鑒定種群不夠完整，使得人們無法全面了解普洱茶發酵過程中的種群情況，多數只是鑒定到了優勢菌種或是在特定的培養中為優勢的菌群。日本學者M.Abe等[30]應用PCR變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）技術研究普洱茶發酵過程中微生物群落結構，對不同發酵階段的普洱茶中微生物種群進行了研究，發現普洱茶2種優勢種群，同時在用孟加拉紅培養基，PDA 培養基在 30 ℃ 培養時也證實了這一結論，進一步說明了將分子生物學方法用于普洱茶發酵過程中微生物學研究是可行的[30]。

劑量組也對普洱茶鮮葉中的內生菌[10]進行了研究，普洱茶渥堆發酵微生物的研究以及普洱茶區空氣微生物[11-12]的研究中都分別采用了PCR，Polymerase Chain Reaction（聚合酶鏈式反應）分子生物學的方法，擴增細菌的16SrDNA和真菌的ITS序列測定分析或 PCR-變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）對參與或有可能參與普洱渥堆發酵的微生物進行了鑒定。

呂昌勇[31]利用宏基因組學高通量測序研究方法認為，細菌是普洱茶渥堆發酵過程中的主要菌群，占總微生物的76.26%；真核生物次之，占16.35%。目前應用高通量測序在普洱茶渥堆發酵微生物的研究中很少涉及，趙 明等[32]在利用高通量測序方法研究普洱茶發酵過程中的微生物，對參與普洱茶渥堆發酵微生物種群作了初步的鑒定。Wei Zhang等[33]通過實時定量PCR研究認為，煙曲霉、微小根毛霉、熱帶假絲酵母菌、鐮刀菌、Thermomyces lanuginosus、Aspergillus niger、blastobotrys adeninivorans、Rasamsonia emersonii、Asper-gillus tubingensis、Rasamsonia cylindrospora、Rasamsonia byss-ochlamydoides等嗜熱菌在普洱茶渥堆發酵過程中起著重要的作用。

3 普洱茶發酵微生物研究進展

3.1 普洱茶微生物種群

陳宗道等[14]從20世紀80年代開始研究普洱茶中的微生物以來，已經證實細菌、酵母、霉菌和放線菌都參與了普洱茶的發酵。

周紅杰和趙龍飛等[6，18]先后從普洱茶和普洱茶翻堆樣品都分離得到了黑曲霉、酵母菌、米曲霉、根霉、灰綠曲霉和極少的細菌。方 祥等[23]，M.Abe等[30]以及楊瑞娟等[34-35]從不同年代的普洱茶和渥堆發酵的普洱茶中分離得到了霉菌（黑曲霉、微小根毛霉、牛根毛霉）、酵母、細菌（芽孢桿菌，Bacillus coagulans，球菌，無芽孢短桿菌，乳酸菌，植物乳桿菌，類乳酸片球菌和大量嗜熱細菌）、放線菌。呂昌勇[31]認為，普洱茶發酵初期的優勢細菌是變形菌門（Proteobac-teria），隨后厚壁菌門（Firmicutes）上升成為優勢菌，放線菌門（Acti-nobacteria）與Firmicutes在發酵后期繁成為共同優勢菌。原料的優勢真菌歸類為no-rank-Fungi（65.39%），發酵過程中，曲霉屬（Aspe-rgillus.sp）真菌一直處于優勢；發酵中期環境中的根毛霉屬（Rhizomucor.sp）先升高后降低。

3.2 優勢菌種與普洱茶品質的關系

近年來，關于普洱茶與微生物關系研究更多地集中在優勢菌種對普洱茶品質影響的研究，多數是將分離純化后的微生物再接種到普洱茶中，用來研究普洱茶品質改變情況。陳秀燕等[36]將灰綠曲霉和青霉接種到普洱生餅茶和散茶中，能明顯加速普洱茶陳化的作用，且能提高茶湯的香氣。研究表明，灰綠曲霉和青霉接能加速茶葉中纖維和果膠的降解，使普洱茶更加甘滑、醇厚。董文明等[27]認為，普洱茶發酵過程中，黑曲霉產淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶、果膠酶，酵母菌產淀粉酶、蛋白酶、果膠酶，細菌只產淀粉酶、蛋白酶。經過這些酶的作用后普洱生茶形成了普洱熟茶甘厚濃醇的品質特征。周才碧等[28]利用優勢菌株黑曲霉純種對普洱茶進行發酵試驗，得到的茶樣香氣濃純、湯色呈黑褐色、滋味較平和，且茶色素發生明顯變化，表明黑曲霉可以作為發酵用菌種，適于普洱茶的渥堆發酵?？笛嗌降萚37]對普洱茶在普洱茶發酵過程中添加外源酶和接種酵母，其結果表明，使用外源酶可增加普洱茶所含水溶性總糖及游離氨基酸的含量，接種酵母可明顯加速普洱茶茶多酚的轉化。

4 普洱茶發酵過程中微生物學研究存在的不足及展望

4.1 存在的不足

目前對參與普洱茶發酵微生物的研究都集中在優勢菌和能培養的微生物上，對于非培養微生物研究仍然很少涉及，對于這些微生物在普洱茶渥堆發酵中的作用研究就更無從談起。對于普洱茶發酵微生物對普洱茶品質的轉化作用及其機制研究首先就要解決非培養的微生物鑒定工作。目前關于普洱茶中微生物發酵的研究已經日趨成熟，宏基因組學[38]也更多地應用于普洱茶發酵微生物研究中來，多數都是停留在第一代測序研究上。關于微生物對普洱茶品質的影響，更多的是在于研究接種某一種或多種優勢微生物或酶對發酵品質的影響，而忽略了普洱茶發酵微生物群落對普洱茶發酵的影響。

4.2 展望

微生物第二代測序技術在環境微生物的研究方面已經非常成熟，已經廣泛應用于環境微生物的研究[39-40]，而對普洱茶發酵中的微生物的研究結果卻少之又少。呂昌勇[31]和趙 明等[32]利用高通量測序方法對普洱茶渥堆發酵中的微生物進行了研究，這一技術的應用為普洱茶中非培養微生物的研究提供了新的可能。高通量測序技術在環境微生物的研究中常比PCR-DGGE法檢測靈敏度高 3.8～39.4倍[41]。

利用高通量測序技術將普洱茶從鮮葉到普洱熟茶成品的微生物組成作出系統研究，并總結出這些微生物生長和消亡規律，對普洱茶鮮葉、干茶、渥堆的每個時期和成品的微生物生態系統作出系統的研究，探明這些微生物在每個時期的組成情況如何，以使人們能更好地探明普洱茶在發酵中是否有有害微生物的參與，為明確這些微生物在發酵過程的作用提供更為全面而系統的研究對象，從而有利于更好地了解普洱茶發酵中微生物的消亡規律和其對普洱茶品質的影響。

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