利用16S rDNA克隆文庫研究豬場污水微藻凈化后菌群的變化

盛清凱++劉艷艷++孫中亮+++孫利芹++劉雪++朱昌雄

摘要：為促進豬場污水治理，研究微藻凈化對豬場污水菌群的影響，將小球藻接種于含60%沼液與40%水的豬場污水進行批式模式培養，循環三次后將小球藻液離心，檢測豬場污水、小球藻液以及離心后上清液中的水質指標及菌群變化情況。菌群采用16S rDNA克隆文庫方法檢測。結果顯示，和豬場污水相比，小球藻液及上清液中的化學耗氧量（COD）、總氮、氨氮、總磷、銅、鋅等含量極顯著降低（P<0.01）。除未知菌群外，豬場污水中的主要菌群為Firmicutes 群和Bellilinea群，含量分別為12.25%和11.22%；小球藻液中主要菌群為小球藻和Cytophaga 群，含量分別為42.42%和12.12%；上清液中的主要菌群為Dyadobacter、Cytophaga、Algoriphagus 群和Pedobacter 群，含量分別為25.00%、14.00%、11.00%和10.00%。豬場污水和小球藻液中未發現共存的微生物，小球藻液與上清液中皆含有Cytophaga群和Dyadobacter、Pseudomonas、Flavobacterium、Algoriphagus、Flexibacter群。表明接種小球藻可以凈化豬場污水中的氨氮、總磷以及重金屬，改變污水中的菌群，污水凈化可能是小球藻和其共存菌共同作用的結果。

關鍵詞：小球藻；豬場污水；16S rDNA克隆文庫；凈化；菌群

中圖分類號：S828.4文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2017）02-0093-06

隨著集約化養殖業的發展，糞污污染問題日益引起人們的重視。隨著2015年國家《水污染防治行動計劃》及2016年國家《土壤污染防治行動計劃》的實施，糞尿處理問題尤其需要解決。由于總體畜禽養殖利潤低、污水處理設施投入高、處理后的水價格低，且養殖戶處理污水的意愿不高，養殖污水處理成為目前養殖污染處理的難點之一。和城市污水、工業污水相比，養殖污水量大，氮、磷含量高，水體微生物成分復雜，且可能含有致病菌，因此養殖污水處理難度更大。

微藻因適應性強，生長速度快，能夠利用污水中的氮、磷[1]，并且具有抗腫瘤、抗高血壓[2，3]等生理功能而受到畜禽養殖業的廣泛關注。利用微藻處理污水不但可以降低污水處理設施的高投入，而且可以用廉價的污水生產高附加值的微藻飼料、微藻保健品等。微藻自20世紀70年代起開始用于污水處理[4]。菌藻共生技術的出現進一步提升了微藻處理污水的效果[5]。由于微藻處理污水的效果受水體中微生物以及外源微生物的影響[6]，明確微藻凈化污水過程中微生物的變化有助于進一步明確微藻凈化污水的機理、提升菌藻共生技術、增強污水處理效果及促進微藻的生長，從而促進水資源的高效利用。但養殖污水中微生物種類及含量不明，制約了其高效利用。傳統的微生物培養方法存在耗時長、工作量大、絕大多數微生物不能培養等缺點，無法準確確定污水中的微生物。16S rDNA克隆文庫不需要環境中微生物的純培養，能夠更全面系統地揭示各種未知的微生物，目前已應用于油田及燃料[7]等，但尚未見用于養殖污水的報道。本研究采用16S rDNA克隆文庫技術分析微藻凈化的豬場污水中菌群的變化，可為豬場污水治理提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

小球藻（Chlorella vulgaris），煙臺大學提供。豬場污水，煙臺市某豬場提供，為60%沼液與40%水。Stool DNA試劑盒，美國OMEGA公司生產。pMD18-T Vector試劑盒以及Ex Taq HS DNA熱啟動聚合酶，寶生物工程（大連）有限公司提供。GenEluteTM Gel Extraction Kit膠回收試劑盒，美國Sigma Aldrich公司生產。

1.2小球藻凈化豬場污水及水質指標檢測

將小球藻接種于1.5 L以豬場污水為培養液的柱狀光生物反應器中，小球藻初始接種濃度為OD680=0.3，人工光源24 h連續光照，光照強度為150 μmol/（m2·s），培養溫度為23～28℃，空氣流量為0.2 L/min。培養開始時采用批式模式培養。當培養液中污染物濃度降低至《畜禽養殖業污染物排放標準》所規定的允許排放濃度以下時，再用50%體積比的豬場污水以50%的體積比置換培養液，繼續進行光照培養，如此循環三次。最終將小球藻溶液5 000 r/min離心10 min后收集上清液。利用小球藻共凈化豬場污水三批，每批將豬場污水、最終的小球藻液、離心后的上清液樣品各采集三個重復，用于水質指標檢測。

COD根據GB/T 11914—1989檢測，總氮含量根據HJ 636—2012檢測，氨氮含量根據HJ 535—2009檢測，總磷含量根據GB/T 11893—1989檢測，銅與鋅含量采用火焰原子吸收光譜法測定。

1.316S rDNA克隆、轉化和文庫構建

1.3.1DNA提取及PCR擴增將豬場污水、最終的小球藻溶液、離心后的上清液三個樣品12 000 r/min離心5 min，收集菌體后， 使用試劑盒抽提DNA。

利用引物27F/16SF：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R/16SR：5′-GGYTACCTTGTTACGACT T-3′ 擴增16S rDNA。

PCR擴增體系（50 μL）：模板DNA，2 μL；Ex Taq HS DNA熱啟動聚合酶，0.25 μL；10×buffer，5 μL；27F/1492R（10 μmol/L），各2 μL；最后用無菌超純水補足至50 μL。

PCR反應條件： 95℃預變性3 min；95℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 90 s，35個循環；72℃延伸10 min，4℃保存。

用GenEluteTM Gel Extraction Kit膠回收試劑盒純化PCR產物。

1.3.2PCR產物連接、轉化和克隆文庫構建根據pMD18-T Vector試劑盒說明和分子克隆方法連接PCR產物并將連接產物轉化到感受態細胞DH5α中。用X-gal/IPTG AMP抗性篩選平板選擇具有氨芐抗性的白斑單克隆轉化子，提取質粒，通過M13通用引物（正反方向）進行PCR擴增，經瓊脂糖凝膠電泳，選取擴增片段大小在1 700 bp左右的陽性克隆構建16S rDNA文庫。

1.3.316S rDNA克隆文庫測序及分析對構建的3個16S rDNA克隆文庫中經 M13通用引物鑒定后的陽性克隆質粒（每個克隆文庫篩選110個陽性克隆子）進行測序。對每個克隆子的正反向測序結果使用DNAStar軟件進行拼接，去除載體序列。將序列在Unix系統服務器上進行本地BLAST數據庫比對，將代表序列使用MEGA5.2軟件進行系統發育學分析。

1.4數據處理

采用SAS （V9.1） 軟件對水質指標數據進行處理；采用ONE-WAY ANNOVA進行方差分析；采用Student-Newmnan-Keuls法進行多重比較，P<0.01為差異極顯著。

2結果與分析

2.1小球藻對豬場污水的凈化效果

與豬場污水相比，小球藻液中的COD、總氮、氨氮、總磷、銅及鋅含量分別降低23.08%、56.24%、72.37%、66.21%、84.62%及90.57%，上清液中的COD、總氮等含量進一步降低，彼此差異極顯著（P<0.01）。

3討論與結論

沼氣工程是目前常用的處理糞水的方法之一。然而由于資金、技術及環境等多種因素的制約，大量沼氣工程未能實際運行或運行效果差，許多豬場將沼氣池中未發酵的沼液與沼氣池外的豬糞水混在一起外排，沼液、沼渣成為一種新的污染源。本試驗用小球藻凈化沼液，有助于豬場污水的高值化利用。

本試驗用小球藻處理沼液污水后氮、磷含量皆降低，其凈化效果與其它報道[8]結果相似。氮磷含量降低的機理與小球藻的增殖有關[9]。藻類在生長過程中以CO2為碳源，吸收污水中的氮、磷等營養物質，通過藻類細胞中葉綠素的光合作用生成藻類自身的營養物質，完成藻類細胞的增殖。

小球藻的增殖對豬場污水中菌群的影響尚未見報道。本試驗結果表明，小球藻增殖后，污水中的菌群組成發生了改變。豬場污水中的主要菌群為厚壁菌（Firmicutes）及綠彎菌（Bellilinea），二者在沼氣發酵過程中發揮了重要功能[10，11]。小球藻液中未發現這兩種主要菌以及Rhodopseudomonas、Longilinea等次要菌群。小球藻液中除小球藻外主要的菌群為擬桿菌門菌（Cytophaga）。污水中厚壁菌（Firmicutes）及綠彎菌（Bellilinea ）的消失與小球藻的增殖可能存在關聯。小球藻液與上清液中皆含有主要菌群Cytophaga 以及次要的Dyadobacter、Pseudomonas、Flavobacterium、 Algoriphagus、Flexibacter等菌群。上清液中Dyadobacter、Pseudomonas等次要菌群含量的增加應與小球藻的離心有關。小球藻可能通過其分泌的球藻素[12，13]影響污水及上清液中其它菌的生長。

小球藻增殖后污水中菌群的功能也發生了變化。小球藻液中的擬桿菌門菌（Cytophaga）與纖維素降解[14]及氮硝化[15]有關。苗禎等[16]報道北極小球藻的藻際環境內也有Cytophaga。小球藻與Cytophaga之間的關系有待進一步研究。小球藻液中Dyadobacter可能與COD及氮磷的去除有關[16-18]。小球藻液中變形菌門假單胞菌屬（Pseudomonas）也與COD去除及氮磷代謝有關[18]，Pseudomonas與小球藻在無機氮與有機碳的去除上存在菌藻共生協同現象[19]。小球藻液中的Methylobacillus flagellatus KT與氧化酶[20，21]及磷[22]的代謝相關。小球藻可能和其溶液中的Cytophaga、Pseudomonas等菌或其它未知菌形成藻菌聯合體[23]共同去除污水中的氮、磷或其它物質。

綜上，接種小球藻可以凈化豬場污水中的氨氮、總磷，改變污水中的菌群。污水凈化可能是小球藻和其共生菌共同作用的結果。

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